华大最新成果！基于全扫空间蛋白质组首次创建小鼠脑空间蛋白质组图谱
空间蛋白质组学可以反映组织中不同类型细胞的功能状态，在生命科学的研究中受到越来越多的关注。为了获得组织上空间蛋白质组学信息，通常使用激光捕获显微切割仪（LCM）从FFPE组织中切取微小样本，然后用质谱进行蛋白质组分析，FFPE样品的蛋白质制备一般包括脱染色、解交联、肽段制备等工作流程，目前依赖于传统的多步操作的复杂前处理流程，通常会导致蛋白质提取效率较低，从微量FFPE组织中高效提取蛋白质仍是空间蛋白质组学技术中的一个主要挑战。
鉴于目前存在的空间蛋白质组学技术挑战，2023年11月，华大基因质谱团队在分析化学领域权威期刊Analytical Chemistry（IF=8.0）上发表了题为“Routine Workflow of Spatial Proteomics on Micro-formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues”的文章（点击文末“阅读原文”查看文献），对微量FFPE组织的蛋白质组学分析过程进行了技术评估，并优化了前处理步骤，成功建立了一个最小面积为0.002 mm2（~10个细胞）的FFPE样本空间蛋白质组学分析工作流程，并利用该工作流程连续收集小鼠大脑的微量FFPE组织，首次初步构建了小鼠大脑的全扫空间蛋白质组学图谱，该图谱显示，蛋白质丰度和功能富集具有空间依赖的典型特征。
研究思路
图1 微量FFPE样本的空间蛋白质组学工作流程
主要成果
1. 评估HE染色对微量FFPE组织蛋白质鉴定的干扰
HE染色（Hematoxylin and eosin stain）是对FFPE组织的常见处理方法，用于定位组织或细胞，为了避免HE染色对蛋白鉴定的干扰，一般的前处理流程引入了去除微量HE的脱色程序，如SP3和SISPROT技术。然而，微量样本制备过程中的额外处理会造成蛋白质损失，可能导致蛋白质提取率较低。本研究经过系统性评估，发现脱色处理对微量FFPE样品中蛋白质的鉴定有明显的干扰，微量FFPE组织 (<5 mm2) 中HE染色对蛋白质鉴定影响很小，脱色过程将不再是必要的步骤。
图2 评估微量FFPE组织上HE染色的必要性
2. 微量FFPE组织蛋白解交联步骤的优化
蛋白质解交联是从FFPE组织中提取蛋白质的必要步骤。然而，如何在微量FFPE样品中进行有效的解交联存在一定的挑战。本研究通过系统优化和全面评估，找到了在微量FFPE组织上进行蛋白质解交联的最佳条件。
图3 微量FFPE组织蛋白解交联步骤的优化
3. 简化微量FFPE组织的蛋白质制备方法
为了达到完全消化蛋白质的目的，常规样本处理步骤包括蛋白质变性，烷基化和还原等复杂操作，本研究评估了在微量FFPE组织中进行这些复杂处理的必要性，发现SDS缓冲液对蛋白质鉴定有负面影响，而不进行还原和烷基化的情况下蛋白质的鉴定率更高。此外，长时间胰蛋白酶孵育会造成体积损失，而脱盐处理在微量水平上鉴定蛋白质并不需要。通过优化实验条件，建立了一种简化的溶液制备方法，将所有操作集中在一种溶液和一个试管中，避免了可能导致肽损失的几个步骤。
图4 不同制备方法蛋白鉴定数的评估
4. 不同切割面积的微量FFPE组织蛋白质组学特征
利用优化的实验流程，可以在最小尺寸为0.002 mm2 FFPE组织鉴定到近1,000蛋白质，约10个细胞的FFPE样品中即可检测到足够多的蛋白质。但0.002 mm2 FFPE组织的收集率较低，不满足空间图谱构建的需求（图5B），为了满足收集率和鉴定量，本研究比较了0.05 mm2和0.5 mm2两种面积样本生成的蛋白质组数据，用于平行比较这些样本的蛋白质丰度分布和生物学功能（ 图5C、D），结果显示0.05 mm2面积下，样本几乎全部可以收集到，两种面积鉴定到的蛋白质从定量分布和功能富集上近似，因此选择0.05 mm2作为构建图谱的最佳切割面积。
图5 不同切割面积的微量FFPE组织蛋白质组特征
5. 构建小鼠大脑全扫空间蛋白质组学图谱
在显微镜下，选择一个约3 mm2的小鼠脑组织的HE染色特定区域，该区域横跨大脑皮层和海马的典型脑区。设置0.05 mm2作为切割区域（目前小鼠脑研究中最小尺寸），在连续模式下切割微量FFPE切片，得到71个标有编号的样本。按照优化的工作流程，微量FFPE样本被处理后进行质谱检测，去掉3个鉴定率极低的样本，对68个鉴定率满意的样品进一步进行了蛋白质丰度的空间分布评估。
使用K-means聚类将68个micro-FFPE样本根据蛋白质丰度分为高、中、低三组，并观察到它们在空间区域的分布特征，其中丰度相对较高的蛋白质组 (黄色网格) 主要位于右侧，丰度中等水平的蛋白质组 (粉色网格) 则分布在左侧以及中间区域，而丰度较低的蛋白质组 (蓝色网格) 随机分布，说明本技术提取到的蛋白质具有空间依赖特征。通过多重皮尔逊相关性分析，发现右侧样本相关性较高，而左侧相关性较低，体现了相关性的空间变化趋势，且在海马区和皮层区，都发现了样本的空间异质性。此外，根据蛋白质富集分析和基因组富集分析，发现与脑功能相关的蛋白在右侧区域高度富集，这些结果表明蛋白质丰度与特定脑区的功能密切相关。通过对蛋白质丰度聚类、区域丰度相关性和解剖区功能富集的综合分析，可以初步构建小鼠大脑蛋白质组学图谱。
图6 小鼠大脑空间蛋白质组初步图谱
科技君点睛
本研究通过对微量FFPE组织的蛋白质组学分析全过程的优化，成功建立了一个最小面积为0.002 mm2的FFPE样本空间蛋白质组学分析工作流程，并基于此流程，初步构建了小鼠大脑的空间蛋白质组学图谱。
华大基因质谱平台在空间蛋白质组方向深耕多年，此前已自主发表胃印戒细胞癌空间蛋白组学研究成果、结直肠癌空间蛋白组文章，本次基于全扫的小鼠大脑的空间蛋白质组学图谱文章更彰显了华大在空间蛋白质组领域的技术实力。华大基因质谱平台可提供从组织切片、到LCM切割、质谱上机、信息分析的全流程服务，专业博士团队全程指导，采用timsTOF Pro高性能质谱仪进行检测，在鉴定深度、定量稳定性和准确性方面均表现优异。
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编辑：市场部
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