项目文章 | Nature子刊：蛋白质组解析白血病干细胞维持的调控新机制
急性髓系白血病（AML）是一种侵略性的血液恶性肿瘤，大多数患者也无法被治愈，因为无法根除白血病干细胞（LSCs）。白血病干细胞的命运是由其固有机制和与其生态位的相互作用决定的，虽然白血病干细胞被证实可以通过重新启动衰老而被根除，但越来越多的研究发现，在各种应激信号下，如肿瘤基因激活、活性氧（ROS）的失调、DNA损伤和端粒消耗，LSCs表现出对衰老的抗性，这表明在LSCs中存在使衰老诱导和应激信号通路之间的联系分离的机制。但LSCs抵抗衰老和重塑生态位以获得适合干性的微环境的具体关键调控因子仍不清楚。
近期，华中科技大学刘凌波团队在白血病领域知名期刊Leukemia（IF=12.9）在线发表了题为“RAB27B-regulated exosomes mediate LSC maintenance via resistance to senescence and crosstalk with the microenvironment”的研究论文（点击文末“阅读原文”查看文献）。
该研究发现RAB27B（一种调节外泌体分泌的基因）在LSCs中过度表达，并与急性髓性白血病患者的不良预后相关。体外和体内实验结果表明，RAB27B水平的升高可抑制LSCs的衰老，维持其干性。华大基因质谱平台为该研究提供了iTRAQ定量蛋白质组技术服务。
主要研究成果
01
RAB27B在LSCs中过表达，并与AML患者预后不良相关
该研究首先分析了已发表数据集中的AML数据，发现RAB27B在AML患者的骨髓和外周血中显著上调。在富含LSCs的白血病细胞系中也发现RAB27B过度表达。与正常细胞和其他癌细胞相比，AML患者的CD34+细胞中RAB27B的表达显著上调。RAB27B的高表达与AML患者的不良预后相关。
图1 RAB27B在AML LSCs中过表达，并与AML患者预后不良相关
02
RAB27B在AML LSCs中的特异性过表达可阻止其衰老并维持其体外干性
为了进一步探索RAB27B是否参与调节AML LSCs的抗衰老，研究人员首先使用短发夹RNA（shRNA）去除其在人AML细胞系中的表达。研究人员发现RAB27B敲低（KD）显著抑制了细胞生长，增加了细胞周期阻滞和老化相关活动，提高了老化相关分泌表型因子，并抑制了凋亡。RAB27B的敲除也抑制了来自细胞系和原发性AML患者的CD34+细胞的生长，并诱导了细胞老化。RNA-seq分析显示，RAB27B的敲除增强了衰老相关通路，并减少了细胞周期和LSCs相关途径。这些发现表明，在AML LSCs中过表达RAB27B可以防止细胞老化并促进干细胞的维持。
图2 RAB27B下调诱导AML LSCs体外衰老和干性丧失
03
RAB27B在AML LSCs中的特异性过表达促进了体内白血病的发展
研究继续探索了RAB27B下调对AML LSCs的功能影响，RAB27B下调（shRAB27B组）小鼠显示出体重减轻减少、生存率增加、AML细胞减少。为了研究RAB27B的持续抑制是否会影响LSCs的自我更新能力，研究人员将来自指定受体小鼠的7x105 hCD34+ AML细胞移植到另一只亚致死照射的NCG小鼠中移植后8周，与对照组相比，shRAB27B组骨髓中hCD45+CD34+和hCD34+CD38+细胞的百分比显著降低。这表明RAB27B下调可以通过在体内根除LSCs来阻止AML的发展。
图3 AML LSCs中RAB27B下调可有效阻止AML的发展
04
RAB27B在AML LSCs中的特异性过表达选择性地促进富含衰老诱导蛋白的外泌体的装载和分泌
为了进一步研究RAB27B是否可以选择性地促进LSCs外泌体的负载和分泌，从而诱导LSCs衰老的抗性，研究人员对KG1a shCTRL-Exos和KG1a shRAB27B-Exos进行了定量蛋白质组学分析，发现KG1a shRAB27B-Exos中下调的外泌体蛋白参与了外泌体的生物发生和分泌，如内吞作用、MVB组装和囊泡融合。与诱导细胞衰老相关的途径特异性富集，表明依赖RAB27B的外泌体可能具有特殊的衰老功能。KG1a shRAB27B-Exos上调的外泌体蛋白与细胞周期、DNA复制和DNA修复有关，参与促进细胞增殖。研究结果显示，RAB27B调控的外泌体含有15种衰老诱导蛋白，ITGB3、SRSF1、HMGA1和p18具有促进功能。WB分析进一步证实，在KG1a shRAB27B-Exo中，ITGB3、SRSF1、HMGA1和p18蛋白水平显著降低，而在RAB27B-KD细胞中，这些蛋白水平升高。共免疫沉淀和免疫荧光分析证实了衰老诱导蛋白与MVB中RAB27B的相互作用和共定位。以上结果表明RAB27B有选择地促进富含衰老诱导蛋白的外泌体的排泄，并通过直接结合影响它们装载到MVB中。
图4 RAB27B下调选择性抑制LSCs中富含衰老诱导蛋白的外泌体的装载和分泌
05
RAB27B可能选择性地促进不同外泌体群体的生物发生和分泌
研究发现AML LSCs来源的外泌体导致骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）衰老，同样在体内也选择性诱导BM-MSCs衰老。为了确定AML LSC外泌体诱导骨髓间质干细胞衰老的分子机制，研究人员对AML LSCs来源的外泌体处理的BM-MSCs的转录谱进行了表征，发现AML LSC来源的外泌体主要通过增强DDR、ROS和PI3K/AKT/mTOR信号通路来促进BM-MSCs衰老。
接着探索了来自衰老BM-MSCs（senMSCs）的RAB27B依赖性外泌体在人类AML LSCs增殖中的作用。使用shRNA慢病毒敲除BM-MSCs中的RAB27B，并将其与KG1a-Exos共培养，然后从senMSCs上清（shCTRL-Exos和shRAB27B-Exos）中分离出它们的外泌体。定量蛋白质组学检测发现，senMSC shRAB27B-Exos中下调的蛋白包括CFI、LAMB2和GANAB，这些蛋白已被证实参与LSCs维持，对senMSC shRAB27B-Exos中这些下调蛋白的氧化石墨烯分析表明，这些蛋白与细胞增殖增强有关，如ERK1和ERK2级联的正调控，以及外源性凋亡信号通路的负调控，说明在这些LSCs衍生的外泌体诱导的衰老MSCs中，RAB27B可能选择性地促进不同外泌体群体的生物发生和分泌，从而增强LSCs的自我更新。
科技君点睛
研究团队通过详细的实验和分析，证实了RAB27B调节的外泌体通过抗衰老和与微环境的串扰来介导LSCs的维持，结果表明在LSCs及其受过驯化的衰老MSCs中特异性增加的RAB27B是LSC抵抗衰老和维持的枢纽分子，通过特异性靶向RAB27B可能是重启LSC衰老，阻断LSCs诱导的生态位衰老，并通过调节选择性外泌体的生物发生和排泄来阻碍LSCs诱导的衰老生态位的干细胞促进作用的关键策略。这些研究发现为治疗AML患者提供了一种新的靶向治疗策略。
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供稿：Carol
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