IF 37.6！EUR HEART J：华大科技助力湖北时珍实验室、湖北中医药大学、华科大协和医院等单位揭示瓣膜钙化发病创新机制
钙化性主动脉瓣病（CAVD）是一种常见的心血管疾病。截至目前，有效能干预或减缓CAVD发病进展的药物还未被发现。一旦出现严重的CAVD症状，唯一有效的治疗方案是选择瓣膜置换手术。因此，探索有效的疾病靶点，可为抑制瓣膜钙化的药物研发提供依据。尽管在很多前期的研究中，通过构建CAVD的单细胞测序图谱，对瓣膜钙化的病理进程进行了深入解析，但其主要调节因子和确切的分子机制仍然难以捉摸，控制瓣膜间质细胞（VIC）成骨转变的确切信号机制尚不清楚。
北京时间2024年7月8日，由湖北时珍实验室、湖北中医药大学的许康教授、王春莉副教授团队联合华中科技大学附属协和医院董念国教授团队等国内多家单位，在原有研究基础上继续发掘主动脉瓣膜钙化发病创新机制，通过对9个从年轻、老年到钙化患者的主动脉瓣膜样本进行单细胞测序及深度分析，成功地解析了瓣膜间质细胞（VIC）病理转化的全过程，并鉴定出了lumican（LUM）关键分子在CAVD中具有促钙化作用。
该成果发表在心血管领域全球排名前2的顶级医学期刊European Heart Journal（最新IF=37.6，中科院一区，JCR Q1）上（点击文末“阅读原文”查看文献）。该项目由华大科技提供单细胞测序服务。
主要研究成果
01
主动脉瓣膜单细胞图谱绘制
该研究选取年轻、老年到钙化患者，各3个重复，总计9个主动脉瓣膜样本进行高通量单细胞测序，鉴定到94,277个细胞，根据基因表达进行细胞分群，共获得11个细胞簇，包括6个瓣膜间质细胞簇；2个钙化瓣膜间质细胞簇；1个瓣膜内皮细胞簇；以及2类免疫细胞簇。
图1 不同状态下主动脉瓣组织的单细胞景观
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a：本研究的总体示意图
b：每个样本中的细胞数量与细胞总数的比率
c：每个簇的数量与单元总数的比率
d：UMAP方法对9个样本、3组和11个细胞亚群中的每一个进行细胞图谱
e：每个样本中不同聚类的比例与该样本中细胞总数的叠加直方图
f：不同聚类的基因表达热图
g：每个聚类的特征表达基因的散点图
02
主动脉瓣膜在钙化过程中关键细胞类群动态变化
通过拟时间分化轨迹分析，包括两个不同的阶段：从年轻组向老年组的过渡和老年组向瓣膜钙化组的过渡，研究团队进一步观察到在第一阶段，大多数cluster1细胞簇在分化末端时出现，并且在这些细胞中特征基因LUM显著上调。此外，在钙化疾病的进展过程中，主要的细胞进化涉及cluster1细胞簇转化为钙化的细胞簇，并且LUM基因的上调在整个过程中持续存在。对钙化细胞簇特征基因进行了GO和KEGG分析显示，这些富集在调节细胞形态发生、细胞外基质组织和组蛋白修饰方面表现出积极的生物学功能。
图2 单细胞测序表明lumican在CAVD的初始阶段起着重要作用
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a：每个集群的UMAP
b：每组中每个聚类的比例直方图
c：分析所有集群的PAGA细胞轨迹
d：基于阶段的假时间分化轨迹分析：从年轻到老年，以及LUM基因表达的变化
e：基于阶段的假时间分化轨迹分析：从老年到CAVD，以及LUM基因表达的变化
f：不同组中每个簇的LUM基因表达的小提琴图
g：GO和KEGG分析显示了VICs中不同簇的常见生物学功能和信号通路
h：CA VICs的GO和KEGG分析（聚类2和聚类6）
03
多维实验验证
研究团队首先从体内、体外、离体组织培养等四个维度包括人瓣膜组织样本、人离体瓣膜组织培养样本、细胞样本、动物样本，证实了LUM与钙化具有显著的正相关性（图3）。
图3 不同钙化模型中LUM表达与钙化水平的相关性分析
OM：成骨培养基，对照表示无钙化诱导
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a：人主动脉瓣样品中LUM和BMP2的IF染色
b-c：a中LUM的IF强度和BMP2
d：a中BMP2和LUM表达的相关性分析
：人主动脉瓣离体培养样品的Von-Kossa和LUM-IF染色
f-g：e中的LUM和Von-Kossa-染色的强度
h：e中的Von-Kossa强度和LUM表达的相关性分析
i：培养的VIC的茜素红和LUM染色
j-k：i中的LUM和茜素红染色的强度
l：i中茜素红强度和LUM表达的相关性分析
m：ApoE-/-小鼠CAVD模型中主动脉瓣的Von-Kossa、BMP2和LUM染色
n-o：LUM和BMP2染色的强度（m）
p：BMP2和LUM表达的相关性分析（m）
在统计分析中，*p<0.05、***p<0.001、***p<0.0001表示显著差异
紧接着，研究团队在许康教授、王春莉副研究员的引领下，通过敲除与过表达，从正反验证了LUM的促钙化作用。进一步通过构建双敲转基因小鼠，再次证实了LUM的促钙化作用（图4）。
图4 LUM在体外、离体和体内均具有促进主动脉瓣钙化的功能作用
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a-b：在OM诱导的条件下，VICs的茜素红染色具有（a）LUM的过表达（OE）和（b）沉默（KD）
c-d：在OM诱导的条件下，用qPCR检测ALPL、Runx2、BMP2表达，In Cell WB，用LUM的过表达（OE）和沉默（KD）的VICs的蛋白质印迹
e-f：在OM诱导条件下具有（e）LUM的过表达（OE）和（f）沉默（KD）的离体培养的人主动脉瓣片的Von-Kossa染色
g：高脂肪喂养的ApoE-/-和ApoE-/-/LUM-/-双敲除转基因小鼠主动脉瓣钙化评估，箭头指示钙化结节
h-k：（g）的统计评估，HF表示高脂肪喂养CAVD模型
在统计分析中，*p<0.05、***p<0.001、***p<0.0001表示有显著性差异，n.s.表示无显著性差异
该研究团队进一步通过多组学分析、细胞分子生物学实验，证实了LUM通过介导糖酵解途径（图5），促进H3组蛋白乳酸化修饰（图6），产生促钙化的作用。这一“分子-代谢-表观修饰”的创新机制，为瓣膜钙化的病理过程提供了新的路径，为瓣膜钙化的治疗提供了新靶点。全文数据正图6幅，补充图19幅，表格7个，工作量大、创新性好。
图5 LUM干扰主动脉瓣钙化过程中VICs的炎症和糖酵解
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a-d：在OM诱导条件下具有LUM过表达（oe）的VIC的RNA-seq，（a）RNA-seq数据上的差异表达基因（DEG）；（b，c）上述RNA-seq的GESA富集分析；（d） KEGG途径富集基于（a），Q值表示为-log10
e-h：在OM诱导条件下，具有LUM过表达（oe）的VICs的非靶向代谢组学分析（使用GC-MS平台），（e）所有代谢组学样品的3D PCA聚类；（f，g）上述代谢组学样品的PCA（f）和OPLS-DA（g）分析；（h） 代谢途径富集基于差异代谢产物，RF：富集因子；p值表示为-log10
i-j：OM和OM加LUM过表达（OML）的VICs的葡萄糖消耗和细胞乳酸水平的比色检测
k-m：在OM诱导条件下LUM过表达的VICs的糖酵解活性检测（oe），Con（对照）表示未处理，（k）不同处理下VICs的ECAR测量；（l） 糖酵解检测；（m） 糖酵解能力测定；OML表示OM加LUM过表达
n-o：用OM和OM加LUM沉默检测VICs的细胞葡萄糖和乳酸水平（sh）。（k-m）在OM诱导（OMsh）条件下，用LUM沉默（sh）检测VICs的糖酵解活性，Con（对照）表示未处理，（k）不同处理下VICs的ECAR测量；（l糖酵解检测；（m）糖酵解能力测定；OMsh表示OM加LUM静音（sh）
s：LUM与CD44/ITGB1的分子对接
t：在敲低CD44和ITGB1的OM诱导条件下VICs的茜素红染色
u-v：在敲低CD44和ITGB1的OM诱导条件下VICs的细胞WB和常规WB实验中
在统计分析中，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、***p<0.0001表示有显著性差异，n.s.表示无显著性差异
图6 LUM通过组蛋白乳酸化作用对CAVD有贡献
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a：流式细胞术分析OM诱导条件下LUM过表达（oe）的VICs中的泛Kla（泛乳酸化）
b-c：不同处理的VICs的LUM和乳酸（Kla）免疫荧光染色，（c）（b）的免疫荧光强度（int）统计评估
d：高脂喂养的ApoE-/-和ApoE-/-//LUM-/-双敲除转基因小鼠主动脉瓣的LUM和乳酸（Kla）免疫荧光染色
e-f：不同处理的H3组蛋白乳酸化、H3K14la和H3K9la位点的表达水平检测，（f）（e）的强度（int）统计评估，将值标准化为H3
g：通过细胞内WB免疫荧光成像检测VICs中泛乳酸化（Pan-CLA）、H3K14la和H3K9la位点的表达水平
h-j：Pan Kla、H3K14la和H3K9la位点表达强度（int）对从16个人主动脉瓣组织分离的VIC的统计评估 [8个健康（h）vs 8个CAVD（Ca）]
k-m：分别基于（h-j）和（补充数据13）对LUM和Pan Kla/H3K14la/H3K9la表达水平的相关性分析
n-p：通过与Pan Kla/H3K14La/H3K9La抗体的免疫沉淀反应对BMP2和Runx2进行ChIP PCR分析
在统计分析中，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、***p<0.0001表示有显著性差异，n.s.表示无显著性差异
研究总结
此项研究通过高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）描绘了瓣膜间质细胞（VIC）病理转化的过程，并强调了lumican（LUM）作为一种新分子在这一过程中的意义。在体外、离体和ApoE-/-//LUM-/-双敲除小鼠上证实了LUM的促钙化作用。LUM通过增强细胞糖酵解诱导VICs成骨，导致乳酸的积累。随后的多组学和分子生物学验证揭示了一种新的LUM驱动的H3组蛋白乳酸化修饰在促进瓣膜钙化中发挥重要作用。
图7 整体研究模式图
华大科技与许康教授团队合作密切，已为该团队近30篇以上SCI论文提供测序分析服务。华大科技将继续致力于助推高质量科研成果产出，为广大的科技工作者服务。
许康教授为该论文的通讯作者，华中科技大学董念国教授为该论文的共同通讯作者，南京医科大学黄玉明博士为论文第一作者，湖北中医药大学王春莉副教授为该论文的共同一作/共同通讯作者。
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文献链接：
https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehae407
供稿：华大科技
编辑：市场部
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