不开玩笑！华大基因CNV-seq有效测序数据量35M reads！

编者语:

染色体数目异常、基因组拷贝数变异 (Copy Number Variations, CNVs) 是导致出生缺陷的重要原因。基于高通量测序 (Next-generation sequencing technology, NGS) 的基因组拷贝数变异检测 (Copy Number Variation sequencing, CNV-seq) 针对于该类异常的产前诊断、遗传病因明确在临床上得到广泛应用。2019年中华医学会专家组发布《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》 (以下简称《共识》) ，明确指出CNV-seq可以作为一线产前诊断技术^[1]。新技术应用如何保障检测准确性，成为目前临床上最为关注的问题之一。

华大基因CNV-seq一直采用35M reads超大测序数据量，为CNV-seq检测准确性提供有力的支撑与保障。

 指南建议CNV-seq为临床一线产前诊断技术

染色体异常，特别是致病性染色体拷贝数变异 (pathogenic Copy Number Variations, pCNVs) 是导致出生缺陷的重要原因，或伴随智力异常、发育迟缓、多发畸形等临床表现。截至目前，已明确由pCNVs所致的染色体缺失/重复综合征已达300余种^[2-3]，综合发病率近1/600^[2]。

传统临床染色体异常检测的金标准核型分析分辨率较低，无法检测片段大小5Mb以下的CNVs^[1]。染色体微阵列分析 (Chromosome microarray analysis, CMA) 虽然具有快速、特异性强、检测范围广的优势，但价格昂贵，通量不高，且由于探针覆盖范围有一定盲区，可能导致部分致病性的CNVs无法被检出^[4-5]。而CNV-seq具有检测范围广、高分辨率、高通量、易操作、兼容性好、低成本等优势，在数据量足够的时候可降低临床漏检，提高染色体异常检出率、是明确遗传病因的高效诊断方式。因此，《共识》中建议具备条件的产前诊断机构也可将CNV-seq作为一线产前诊断技术^[1]。

 测序数据量与CNV-seq检测准确性密切相关

作为依托于NGS的检测技术，测序数据量是影响CNV-seq检测准确性的重要因素。测序数据量不足，假阳性率会明显增高^[6]，使临床决策出现偏差；同时，较低的测序数据量 (3.5~10M reads) 可能存在一定程度的漏检^[7-8]。

▲ 测序数据量不足，CNV-seq假阳性率显著增高

Xie等^[6]从0.1×~8×不同的测序深度对假阳性率的影响中发现，在同样大小的窗口下，随着测序深度不断减小，假阳性率明显增高 (图1) 。在相同测序类型下，测序深度与测序数据量呈正相关，测序数据量越小，假阳性率越高。较低测序数据量的CNV-seq如果用于产前诊断，可能会导致临床错误的妊娠决策。

图1. 0.1x~8x不同测序深度对假阳性率的影响

▲ 测序数据量不足，可能造成CNV-seq漏检

Xie等^[6]研究还发现随着测序数据量的减小，CNV-seq的检出率也是不断下降的，从而带来一定程度的漏检。此外，在临床有效性的验证方面也有多篇报道证明测序数据量不足与染色体异常漏检存在显著联系。Wang等^[7]使用有效数据量为3.5M reads的CNV-seq和Array-CGH同时对443例流产绒毛样本进行检测，结果显示Array-CGH额外检出6例染色体异常，而3.5M reads的CNV-seq未检出。在产前诊断领域，Qi等^[8]通过原始数据量为10M reads的CNV-seq对18例羊水样本进行检测，同时使用SNP-array进行验证，发现SNP-array额外检出1例3.43Mb的Y染色体片段重复，而10M reads的CNV-seq未检出。因此，CNV-seq的测序数据量值得高度关注，较低的测序数据量 (3.5~10M reads) 可能存在一定程度的漏检。

▲ 数据量是影响CNV-seq准确性的关键因素

香港中文大学蔡光伟教授团队等^[5]采用BGISEQ-500测序平台，对1023例产前诊断样本采用15M reads的CNV-seq和CMA同步检测，对于CMA发现的染色体数目异常、已知致病和疑似致病的CNVs，15M reads数据量的CNV-seq完全检出，无一漏检；此外，15M reads CNV-seq额外检出17例被CMA漏检的已知致病和疑似致病的CNVs，且使用qPCR验证为真阳性，取得了比较好的临床效果。可见数据量是影响CNV-seq检测准确性的最关键因素之一。

 华大基因CNV-seq采用35M reads有效数据量

华大基因康孕^®-染色体检测-100K (CNV-seq)，通过对受检样本提取DNA，如胚胎绒毛组织、胎儿组织、外周血等，采用高通量测序技术检测23对染色体非整倍体变异、100Kb以上的缺失、重复，可用于排查自然流产、先天畸形、智力障碍、发育迟缓等疾病的遗传病因。

图2. 华大基因康孕^®-染色体检测-100K

康孕^®-染色体检测-100K (CNV-seq) 的有效数据量高达35M reads，相比低数据量而言，可带来更准确的检测结果，不仅可以减少假阳性带来的临床决策偏差，还可以有效降低假阴性导致的漏检发生，真正做到对临床负责，对受检者负责。华大基因始终秉承基因科技造福人类的使命，以脚踏实地的态度，提供值得信赖的服务，助力精准医学发展。  

参考文献

[1] 中华医学会医学遗传学分会临床遗传学组, 中国医师协会医学遗传医师分会遗传病产前诊断专业委员会, 中华预防医学会出生缺陷预防与控制专业委员会遗传病防控学组. 低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识[J]. 中华医学遗传学杂志,2019,36( 4 ): 293-296.

[2] Nevado, Julián, Mergener R , Palomares-Bralo, María, et al. New microdeletion and microduplication syndromes: a comprehensive review[J]. Genetics and Molecular Biology, 2014, 37(1 suppl 1):210-219.

[3] Weise A, Mrasek K, Klein E, et al. Microdeletion and microduplication syndromes[J]. J Histochem Cytochem, 2012, 60: 346-358.

[4] Hayes J L , Tzika A , Thygesen H , et al. Diagnosis of copy number variation by Illumina next generation sequencing is comparable in performance to oligonucleotide array comparative genomic hybridisation[J]. Genomics, 2013, 102(3):174-181.

[5] Dong Z , Zhang J , Hu P , et al. Low-pass genome sequencing versus chromosomal microarray analysis: implementation in prenatal diagnosis[J]. Genetics in Medicine (2019) https://doi.org/10.1038/s41436-019-0634-7.

[6] Xie C , Tammi M T . CNV-seq, a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing[J]. BMC Bioinformatics, 2009, 10(1):80-88.

[7] Wang M Z , Lin F Q , Li M , et al. Semiconductor Sequencing Analysis of Chromosomal Copy Number Variations in Spontaneous Miscarriage[J]. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 2017, 23:5550-5557.

[8] Qi Q , Lu S , Zhou X , et al. Copy number variation sequencing-based prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid[J]. Prenatal Diagnosis, 2016, 36(6):576-583

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