实验专栏丨方法大盘点之从形态学检测细胞凋亡
很多实验小伙伴跟中洪君表示不知如何区分细胞凋亡和坏死，其实细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍常用形态学检测方法。
形态学检测即发生凋亡的细胞在形态上有一定的特征。
分析方向：细胞内代谢物质的转变、从定性、定量到原位定性定量等，都发展了相对成熟的检测技术，相比于其他检测方法，荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。
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第一种步骤，光学显微镜观察
凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE染色的组织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。
本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之一。
检测方法：
（1）未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。
染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
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第二种步骤，电子显微镜观察
虽然光学显微镜下可以看见胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意,而透射电镜可清楚地观察到细胞结构在凋亡不同时期的变化。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。
检测方法：
透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。
结果评判:
可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
缺点：
（1）只能定性,不能定量;
（2）标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高,不适于大批标本检测;
（3）在组织切片上进行电镜观察时,有时凋亡很难与正常细胞有丝分裂相鉴别,因为两种情况下都可出现染色质浓聚。如同时进行荧光染色,可弥补电镜检查的不足。
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第三种步骤，荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
检测依据：
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的 DNA 特异性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三种染料与 DNA 的结合都是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度，使用时用 PBS 稀释，终浓度为 10 μg/ml。
DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成 1 mg/ml 的浓度，使用终浓度一般为 10 μg/ml。
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第四种步骤，流式细胞技术
流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的。细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息。由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞。
细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。
细胞凋亡的形态学检测结果直观,至今仍是判定细胞是否发生凋亡的金标准,但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力,不适于大量凋亡样本的检测。
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