推动胶质瘤复发监测，国内团队提供外泌体递送纳米胶囊新思路
2022年4月9日/医麦客新闻 eMedClub News/--2022年3月29日，天津医科大学总医院康春生教授团队与天津大学原续波教授团队在 Journal of controlledrelease 上联合发表了题为 “Glioma-derived exosomes hijackthe blood-brain barrier to facilitate nanocapsule delivery via LCN2” 的研究论文，阐明了胶质瘤来源的外泌体穿越血脑屏障（BBB）的潜在机制，并为BBB穿透疗法提供了新的思路。
胶质瘤是发病率最高、临床预后最差的中枢神经系统（CNS）原发性肿瘤，由于胶质瘤恶性增殖、侵袭性生长等生物特征，导致其复发率、致残致死率极高。世界卫生组织(world health organization, WHO)分级系统将胶质瘤分为四级，其中胶质母细胞瘤（GBM）是恶性程度最高的胶质瘤亚型，其患者的平均生存期低于12个月，且5年生存率不超过3%。因此，于GBM而言，使治疗性药物有效到达肿瘤部位，是亟待解决的重点问题。
此前已经有关于外泌体穿越血脑屏障进入血液循环的报道。有研究者在25名胶质母细胞瘤（GBM）患者中识别出7名患者存在含有EGFRvIII mRNA的神经胶质瘤外泌体，但在健康对照组中则没有；并且在胶质瘤切除2周后，没有在患者血液中检测到含有EGFRvIII mRNA的外泌体，这表明胶质瘤外泌体与肿瘤负荷有直接联系，但其潜在机制仍需进一步研究。
该研究团队对胶质瘤外泌体与BBB的作用进行研究时发现，来自原发性脑肿瘤的外泌体可以上调bEnd.3小鼠脑微血管内皮细胞（BMVECs）中脂质运载蛋白-2 (LCN2)的表达。给小鼠腹腔注射和尾静脉注射LCN2后，脑内纳米胶囊的数量显著增加，而这一过程不会破坏BBB的完整性。
为了进一步探究外泌体和LCN2促进脑微血管内皮细胞吞噬作用的机制，研究人员观察了bEnd.3细胞膜流动性的变化，发现外泌体以LCN2依赖的方式增加了bEnd.3细胞膜的流动性。
此外，串联质谱标记定量蛋白质组学和生物信息学分析表明，LCN2受JAK-STAT3通路调控，但不是由外泌体递送，敲除bEnd.3细胞中的LCN2显著消除了外泌体对BMVECs膜流动性的影响。
事实上，在此之前，该团队报道过EGFR-AKT-PTRF通路可以促进胶质瘤外泌体的分泌，而AKT抑制剂MK2206能抑制小鼠胶质瘤模型的进展。研究人员发现，小鼠给药MK2206后，递送的TAB显著减少。基于此，该团队设计了最大化治疗效果的含胆碱纳米胶囊和MK2206组合：先注射纳米胶囊包裹的EGFR单抗Cetuximab；再给药MK2206，这样既能发挥MK2206对肿瘤的抑制作用，又能最大化的使治疗性抗体进入脑胶质瘤，得到最佳的治疗效果。
“双刃剑”—外泌体的异质性
外泌体是一种直径为30-150nm的细胞外囊泡，是调节细胞间通讯的关键介质，在肿瘤发生发展中发挥着重要作用。在这些过程中，它们主要作为重要的信使。
据估计，癌症患者血液中含有的外泌体数量是健康人类血液中的两倍。因此有理由认为，由于肿瘤微环境的显著缺氧特征，肿瘤中需要更多的外泌体来满足细胞间的通信需求。这种情况已在各种癌症中得到证实，如胶质瘤、乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和前列腺癌。
但是，外泌体药物生产工业化是目前面临的重大挑战，存在着异质性的难点，包括大小异质性、内容物异质性、功能和来源异质性，所有这些特征的结合将有可能导致外泌体更高层次的复杂性和异质性。因此，异质性不仅是外泌体应用的前景，也是外泌体的障碍之一。
外泌体在各种疾病的诊断和治疗中的应用研究火热。外泌体的复杂性，为疾病检测和监测提供了一个多指标的诊断窗口。此外，能够向病变细胞输送功能性物质的特性使外泌体有潜力作为基因和药物递送的载体。然而外泌体的异质性又决定了外泌体药物递送系统不能提供一个普适的递药策略，必须根据所传递治疗物质的类型、目标组织的特点等进行针对性的进行策略调整。良好的生物兼容性、稳定性和内在靶向性等使外泌体在药物递送方向大有潜力。
目前外泌体的研究仍处于初级阶段，首要原因就在于该领域里还没有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法，其次是如何鉴别纷繁复杂的外泌体。
超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，通常会与蔗糖密度梯度（其密度从低到高的连续分布）或蔗糖垫（30% sucrose cushion）组合使用，即在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，可使样品中的外泌体应将以1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。这种方法尽管可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点：超速离心的过程耗时耗力，且需要耗费大量的原料；而最大的缺陷在于重复离心操作很有可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量；还有可能会产生污染，因此限制了它们在临床治疗中的使用。
PEG-base沉淀法也是常用方法之一，聚乙二醇（ PEG，8000 kDa）可竞争性结合游离水分子，从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出。通常在4℃下用PEG孵育样品过夜，随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。但该方法也存在一些问题：比如外泌体的纯度和回收率低，存在假阳性（杂蛋白较多或一些难以去除的聚合物）、机械力或化学添加物对外泌体产生破坏等。近年来，基于沉淀的原理来分离外泌体，市场上也研发出了各种商业化的外泌体提取试剂盒，操作简单，无需超速离心，就可获得高纯度和高回收率的外泌体。
此外，循环中非肿瘤外泌体的相对丰度是成功识别肿瘤外泌体的挑战。Fraser等人证明，只有不到10%胶质瘤患者中的血液循环外泌体具有肿瘤特异性和高度异质性；脑脊液被认为是血液的替代品，然而脑脊液的获取困难，缺乏临床实用性。
小结
近几年来，外泌体领域研究持续升温，被誉为细胞治疗的下一个前沿领域。它作为一种药物递送工具，或是一种疾病的治疗制剂，亦或是作为疾病的新型诊断标志物，都具有很大的应用前景。尽管如此，外泌体研究领域仍有许多科学问题未得到解答。
外泌体规模化应用开发关键在于三点：一是依赖于细胞规模化培养条件的提升；二是依赖于外泌体分离纯化方法的提升；三是依赖于外泌体亚群的鉴定分离。然而机遇与挑战并存，外泌体的未来也同样不可小觑。
参考资料：
1.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S016836592200164X#f0035
2.解螺旋《信不信？高效分离外泌体，几小时就能搞定！》
声明：本文涉及内容仅用于探究生物医药前沿进展，不构成任何医疗指导，如有需求请前往正规医院就诊。
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