我命由天不由我！ecDNA,你所不知道的癌症内幕
我命由天不由我
ecDNA,你所不知道的癌症内幕
引
言
随着科技发展，肿瘤的治疗也取得了显著的进展。然而由于肿瘤异质性的存在，导致靶向治疗或者免疫疗法上存在着许多难题。最近热门的ecDNA也许为解释肿瘤的异质性打开了一扇新的大门，对未来肿瘤检测和治疗都有深远的意义。
2019年末两篇关于ecDNA的大作背靠背发表，在朋友圈一阵狂风大作、满屏皆是。惊觉肿瘤细胞还有这样的神操作，感觉进入了一个崭新的世界，又惊又喜。于是一顿恶补，发现在2018年的《Nature Genetics》（ IF：25.45）还有一篇相关的经典文章，题为《Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma》。
在这里小编就和大家看一下这篇文章的内容，给大家分享一下研究思路，说不定下个发NG的就是你！！！
研究背景
ecDNA 是一系列能够编码原癌基因的小片段环状DNA，它们在肿瘤细胞中非常常见，而在正常的细胞中几乎没有，这可能是导致肿瘤异质性的根本性原因。
肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。
整体思路
肿瘤异质性也被认为是癌症治愈的“拦路虎”。以恶性胶质瘤（glioblastoma，GBM）为例，是其中最常见且最具攻击性的脑癌，常规治疗疗效不良，两年生存率仅为15%。为了探寻GBM异质性的原因，杰克逊实验室（Jackson Laboratory，JAX）专门对患者治疗前后以及异种移植（PDX）小鼠模型肿瘤细胞进化过程中的基因组变化进行了研究。
作者利用全基因组测序、高深度全外显子测序和三代长读长测序，分析ecDNA和肿瘤克隆进化的相关特征，对肿瘤异质性的潜在原因进行了多方面研究，并用FISH实验进行验证。
整体实验方案如下图，相关涉及软件我们也进行了贴心标注。
材料和方法
本文选取了12个新鉴定为胶质瘤和1个复发的胶质瘤样本，样本信息如下，其中HF3177为复发的胶质瘤样本。
作者从胶质瘤样本提取神经球细胞，培养并移植到小鼠体内构建颅内肿瘤模型（PDX），每个样本构建3个重复，如下图。
结果展示
1
全基因组基因拷贝数突变图谱构建
对胶质瘤原癌组织、原癌细胞（提取胶质瘤神经球细胞进行培养）以及颅内肿瘤移植模型（PDX）进行低深度的全基因组测序（6.5X）后，构建全基因组分子变异特征谱（如下图）。研究发现组织水平、细胞层面以及移植模型均在拷贝数扩增上有着很大的异质性，例如MYC基因在原癌组织中并未检测到扩增，然而在PDX却发现有大量的扩增。
2
胶质瘤中存在大量的ecDNA
1. 使用AmpliconArchitect检测ecDNA
基于全基因组测序结果，作者利用AmpliconArchitect（Deshpande, V., et al.,）算法（专门用于寻找基因组来源的ecDNA，主要原理是基于全基因组测序的数据比对结果，自动检索基因组断裂点和其他基因组扩增子的区域，结合CNV和SV的结果，形成ecDNA完整序列的报告）共鉴定出了74个来源于21个基因位点的ecDNAs（如下图）。
2. 使用FISH对ecDNA进行验证
随后作者设计了探针，通过FISH荧光杂交对这些ecDNA进行了验证。发现这些ecDNA在同种样本的不同层面（原癌组织，原癌细胞，移植模型）均有很大的异质性，并且在颅内移植模型有大量增多的现象（如下图B）。
3
异质性研究
1.MET_ecDNA标记不同细胞亚群
MET也称c-Met或肝细胞生L因子（Hepatocyte Growth Factor，HFG）受体，是一种酪氨酸激酶（Tyrosine kinase）。MET一般在上皮细胞组织表达。MET的激活机制有多种，比如过度表达、基因扩增、基因变异、自源性或旁源性的HGF激活等。有肿瘤遗传学证据表明MET的变异可以致癌，且多见于多发性髓样瘤和脑胶质瘤。
2. 使用全外显子测序推断亚克隆结构
针对全外显子测序（～1400X）数据，作者使用PyClone来推断肿瘤纯度及肿瘤内部亚克隆结构，发现不管是不同时期还是同一时期原癌组织，原癌细胞以及移植模型都有着很大的异质性（如下图C）。
3.通过CNV预测MET-Capza2可能形成环状结构
通过拷贝数变异发现，MET的拷贝越过间区横跨到Capza2（如下图B），暗示MET-Capza2可能形成环状结构。
4
使用三代数据对ecDNA进行分析
随后文章作者通过三代测序对上述“MET-Capza2可能形成环状结构”的猜测进行了验证。
针对三代的数据，作者通过Canu（Berlin K, et al.）进行了从头组装，并将组装好的contig利用nucmer（Delcher AL, et al.）比对到人的参考基因组上，对融合的contig进行筛选（two contigs were considered to be connected only if they shared a sequence fragment which was at least 5,000 bp long with the minimum 99% identity）发现3个contig都比对到了MET，Capza2区域，并且3个contig之间的overlap超过了5k（如下图），从而进一步证实MET-Capza2的环状结构。
5
多个ecDNA元件在患者GBM
及其移植模型系统中纵向保留
相对于原发的样本，复发样本的Myc_ecDNA比例显著增多（下图C），同时Myc周围共扩增的区域发生了变化，部分区域纵向保留（如下图D，相同样本的原癌组织，原癌细胞以及移植模型有相同的扩增）。
原癌基因EGFR和CDK4则发生了共拷贝（下图B）现象，暗示它们可能处于同一个ecDNA环，而进一步的荧光原位杂交FISH通过共定位则证实了这一结论（下图F），从而揭示了ecDNA不仅仅有单个驱动基因组成，也有可能由多个驱动基因组成。
结论
近年来多篇文献证实癌基因存在于 ecDNA，这无疑给癌症治疗领域带来了崭新的希望。ecDNA可变剪接的异质性，ecDNA扩增的异质性以及ecDNA随机分配的异质性深入地揭示了癌症异质性、耐药性的本质。
然而，关于ecDNA的研究目前还有很多重要的科学问题没有得到很好的解答，例如ecDNA到底是如何形成的？是否存在ecDNA的拼接热点？ecDNA对基因组DNA有何影响，能否结合液相分离来探寻其在细胞间的传递机制？随着技术的进步，我们也会逐渐找到答案。
参考文献
1. Ana C. deCarvalho1,et al.Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma
2. Deshpande, V., et al., Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 392
3. Berlin K, et al. Assembling large genomes with single-molecule sequencing and locality-sensitive hashing. Nat Biotechnol. 2015; 33:623–30.
4. Delcher AL, et al. Alignment of whole genomes. Nucleic Acids Res. 1999; 27:2369–76.
作者|biofan
审稿|童蒙
编辑|amethyst/angelica
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