空间转录组应用领域与研究思路
空间转录组应用领域与研究思路
细胞位置信息对于干细胞分化，组织发育以及肿瘤组织微环境起着重大的作用，那么空间转录组在这些研究领域中是如何设计如何解决科学问题的呢？跟着小编一探究竟吧。
之前跟大家一起浏览了10X Genomics Visium 空间转录组的分析流程（不可错过的单细胞转录组研究新维度：空间转录组），这次跟大家分享一下空间转录组的应用领域以及研究的思路。
根据10X Genomics 官网上公布的利用ST（Spatial Transcriptomics）技术进行研究的文献，可以看到该技术涵盖了肿瘤、发育、疾病等领域，涉及到肿瘤、淋巴、大脑、心脏等各种组织。同时空间转录组技术除了可以应用在常见的哺乳动物，也可以应用在植物学的研究上。
应用领域—肿瘤
我们以2020年1月份发表在Nature Biotechnology 上，对PDAC（胰腺导管腺癌）的研究为例，探讨下空间转录组在肿瘤生物学方面的研究。
该研究主要整合了原ST技术和单细胞RNA技术，弥补了原ST分辨率较低、单细胞RNA缺乏空间信息的缺点，两者互相补充，实现了单细胞水平加空间的全面无偏的癌症组织分析。
研究问题
1.探究PDAC组织的细胞类型，以及与空间相关的细胞亚型
2.探究不同肿瘤样本微环境特点
研究实验设计
如上图所示，作者分两条线进行设计分析，取两名PDAC患者的2例新鲜PDAC-A和B肿瘤组织，同时进行scRNA-seq和ST建库测序分析。
scRNA-seq 分析流程：制备细胞悬浮液—Droplet-based 文库制备—测序—信息分析（鉴定细胞群体类型）
ST-seq分析流程：制备组织切片—建库—测序—信息分析（组织空间成像点表达情况)
最后通过引入多模式相交分析（Multimodal intersection analysis，MIA）整合scRNA和ST数据集进行空间区域的细胞亚群分类。
分析思路与结果总结
scRNA-seq 细胞分类：
利用CNV和细胞分类分析以及荧光标记实验证实了PDAC-A包含两种癌症细胞群cluster1(TM4SF1)和cluster2(S100A4)，PDAC-B包含一种癌症细胞群cluster1（TM4SF1）。
ST-seq细胞分群：
依据病理学进行组织分区，计算Spots表达水平进行PCA分类，发现cluster与组织分类是一致的。
MIA算法整合分析：
1.发现在组织空间受限区域中含有特定的细胞类型和特定细胞亚群的富集。
例如PDAC-A的成纤维细胞特异性基因与ST分析结果中的特定区域的一组基因具有很强的一致性；除此之外，还发现了导管上皮区域富含导管细胞，胰腺组织区域富含腺泡细胞和分泌细胞。
2.依据MIA结果绘制了不同肿瘤样本微环境的特点、免疫环境状态、应激水平以及细胞之间相互作用的模式，有助于对患者预后进行预判。
荧光实验验证：
利用免疫荧光标记实验进行结果验证。
总结
该文章的一大亮点是引入了MIA算法进行空间和单细胞的整合，目前10X Genomics visium 系统大大提升了空间分辨率，一个Spot大概包含1-10个单细胞（主要受研究的组织细胞直径的影响），几乎接近单细胞水平。
应用领域—组织发育
接下来我们一起看一下，发表在Cell上一篇关于人类心脏研究的文章，充分发挥了空间转录组技术，全方位展示了单细胞空间分辨率下的全器官模式。
该研究利用空间转录组（ST）、单细胞（scRNA）和原位测序（in situ sequencing，ISS）技术进行联合分析，最终获得了人类心脏发育的时间、空间的基因表达模式，并深入探讨了不同类型细胞的功能。同时创建了人类胚胎心脏的公共网络资源，共享研究数据和成果。
研究设计
研究设计如上图所示，取来自3个人的孕4.5-5周、6.5周和9周的心脏组织，采用ST、scRNA 和原位测序三种技术手段，从时间、空间两个维度展示了人类心脏发育表达的模式。
ST：组织切片—建库—测序—信息分析（降维聚类，细胞分类）
scRNA-seq：细胞悬液—建库—测序—信息分析（降维聚类，细胞分类）
ISS：获得基因表达的位置信息
最后，结合三种技术进行人类胚胎心脏3D建模，构建了全方位组织基因表达图谱。
分析思路与结果总结
STseq分析：对不同孕期的胚胎心脏切片进行空间转录组技术分析，经过降维聚类，差异表达等分析，最终获得了10个cluster细胞类型，并标注了10个cluster特异性表达的基因。
scRNAseq分析：对孕6.5周胚胎心脏分割两部分进行scRNA建库测序分析，经过降维聚类，获得15个cluster细胞类型，鉴定到的细胞类型与先前报道一致。
ISS分析：利用ISS的亚细胞空间分辨率的特性，运用pciSeq方法创建了一个综合概率，确定scRNA定义的细胞类型的空间细胞图谱，从而实现单细胞分辨率的基因表达时空分析。
作者把运用这三种技术整合的人类胚胎心脏发育的时空基因表达图谱数据提交到一个公共网站上，以共享数据成果。
https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/
总结
ISS技术是2013年发表在Nature Methods 上的一篇文章，主要讲述了这种扩增测序方法。滚环扩增：这种方法依赖一种锁式（padlock）探针，它与目标序列的任一侧杂交，以形成环状模板，进行复制。由于产物是拴在模板上的，这提供了可靠定位，并可通过连续的寡核苷酸探针掺入，实现原位测序。这项技术一般用于序列（RNA，基因）组织细胞定位验证分析。
应用领域—疾病
关于ST技术在疾病研究领域的介绍，我们以2019年12月发表在Scientific Reports 上的一篇关于关节炎的研究为例，一起探讨下这项技术的应用思路。
该研究主要利用ST空间转录组技术，探索了类风湿性关节炎（RA）和脊柱关节炎（SpA）的炎症信号通路。揭示了在RA中，适应性免疫反应与T-B细胞相互作用，而在SpA中，适应性免疫反应与组织修复功能相关。
研究设计
研究设计如上图所示，分别取RA和SpA各3名患者，取其髋部或者膝盖处的滑膜组织进行ST建库测序分析，揭示了慢性炎症性疾病的细胞机制和在组织中的功能的多样性。例如在RA中，适应性免疫反应与T-B细胞相互作用，而在SpA中，适应性免疫反应与组织修复功能相关。
分析思路和结果总结
ST分析：取每个患者病患处3个部位滑膜组织，每个患者3个部位的数据合并在一起作为一个bulk对单个组织切片进行纠正对比。由bulk和单个组织差异表达分析来看，RA与T细胞、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）关联更强，而SpA组织的特征更多在于软骨损伤和修复系统的过程。
功能分析：利用Ingenuity Pathway Analysis
(IPA) and Metascape (http://metascape.org)软件对差异表达基因进行功能和分子网络通路分析，发现RA与适应性免疫应答相关，SpA与细胞外基质相关、与软骨损伤修复过程相关。
细胞类型鉴定：利用Xcell软件进行细胞类型的鉴定，展现了空间组织区域细胞的类型。
应用领域—植物学
前面介绍了人类肿瘤、发育和疾病相关的研究，那么ST技术能否应用于植物学上，为农林研究贡献一种新技术、新方案呢？
答案是肯定的。下面这篇就是2017年发表在Nature Plant 杂志上的一篇关于植物学的研究。
该研究利用空间转录组技术首先在被子植物和裸子植物中模拟了生成空间转录组图谱的可行性，并且在拟南芥中识别了141个表达差异基因和花序组织区域的功能通路上的189个差异基因。
空间转录组学与功能学结合研究，将为植物发育、进化等研究带来新的思路和新的方法。
研究设计
研究设计如上图所示。作者对待研究的植物进行取样，如拟南芥花序、银杏芽等一些植物进行取样，切片，建库测序分析。
分析思路和结果总结
1.讨论被子植物和裸子植物空间转录技术的可行性
a.展示了金银花的叶子芽在一年四季的形态；b.金银花叶子芽两个发育中和休眠中的叶芽基因表达热图，每个颜色条代表一个横截切面，黑色箭头指示位置表示空间Spots的基因表达较低；c.展示不同组织切片空间位点PCA的情况，i为雌性锥组织切片Spots PCA；ii 为不同的组织结构（PT/LO）PCA；d.表明每个Spots的基因和转录本数量在拟南芥中复制。黑线表示每个重复中每个Spots的平均基因或转录本的数量；由b和c的PCA图示可以看到空间转录组信息（Spots）是可以区分组织差异性的。
2.空间转录组技术可用于拟南芥花序分化的分析
a.每个基因在空间上的表达水平。检测到基因表达情况用颜色斑点进行表示。b.拟南芥空间Spots分层聚类（t-SNE分析）。c.微观领域级别的组织域分类用于线性模型分析。d.组织微类别中141个差异基因检验水平。绿点，实际数据中的P值；红点，随机排列斑点标签后的P值；垂直虚线为排列后的P值的0.1％分位数（大约等于0.001），证实了模型的正确性，并用于估计FDR）；水平虚线为任意阈值P（H0）= 0.05。e.列举线性模型中在组织区域微类别之间的差异表达基因。f.花序组织区域功能通路上的189个差异基因。颜色编码如d中所示。g.线性模型检测到的功能通路的例子。由拟南芥的研究可以知道空间转录组技术识别了141个表达差异基因和花序组织区域的功能通路上的189个差异基因。空间转录组学结合功能学研究，将有助于更好的理解研究植物的进化和发育。
总结
这是ST技术发表以来，唯一应用于植物学研究的文章，实际经验还不足，尤其植物样本受到细胞壁，液泡，叶绿体和次生代谢产物的影响，需要对待研究的样本进行特定的优化。
举一反三的研究思路，加上ST升级版的10X Genomics Visium ，相信空间转录组会得到更广泛，更深入的应用。
参考文献
1.Moncada, R., Barkley, D., Wagner, F. et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas[J].Nature biotechnology,2020
2.Asp M, Giacomello S, Larsson L, et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart[J]. Cell, 2019, 179(7).
3.Carlberg K, Korotkova M, Larsson L, et al. Exploring Inflammatory Signatures in Arthritic Joint Biopsies With Spatial Transcriptomics[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1).
4.Giacomello S, Salmen F, Terebieniec B K, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species[J]. Nature plants, 2017, 3(6).
审稿：童蒙
编辑：angelica