三分钟看懂TMT技术 之实验篇
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蛋白质组学在人类疾病研究应用已经有所展开，如癌症、皮肤病、心脏病等。研究包括寻找与疾病相关的单个蛋白，整体研究某种疾病引起的蛋白质表达或修饰水平的变化，利用蛋白质组寻找一些致病微生物引起的疾病的诊断标记和疫苗等。随着精准医疗时代的到来，蛋白质组学在药物研究、临床诊断和个性化治疗等方面将具有更为广阔的应用前景。
TMT™（Tandem Mass Tag™）技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用6种或10种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量。
实验流程
实验主要分为以下几个步骤：
制备蛋白样品
样品的检测
胰蛋白酶解蛋白成肽段，一般为6-30个aa之间
使用TMT标记肽段
标记后的肽段等量混合
液相色谱进行初步分离
一级质谱进行进一步分离
二级质谱进行丰度和肽段检测
得到下机数据，进行生信分析
整体的分析过程如下图。
胰蛋白酶水解
胰蛋白酶是蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。胰蛋白酶以赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C末端侧切割肽。胰蛋白酶的最适pH为7-9。
TMT标记肽段
TMT试剂由三部分组成，报告基团、平衡基团和肽反应基团（如下图），形成6种或10种相对分子质量均等量的异位标签。目前最多能做到16标的TMT。
以10标的为例，报告基团有10种不同的分子量，平衡基团也10有种不同的分子量，与不同的报告基团搭配，能保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比；肽反应基团能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接使肽段连上标记。TMT™试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。
液相色谱分离
液相色谱是一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。使用液相色谱对样品进行初步的分离，以减少一级质谱一次上样量。
一级质谱
质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。
一级质谱中，任何一种TMT试剂标记的不同样品中的同一肽段表现出相同的质荷比，来源于不同标记样本的同一个肽段表现为一个峰；这样可以对肽段进行前期的分离。
二级质谱
二级质谱中，报告基团、平衡基团、连接基团之间的化学键断裂释放出TMT报告基团和平衡基团。平衡基团发生中性丢失，报告基团被质谱仪检测并记录，在质谱低质量区产生了10个TMT报告离子峰，其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息，另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息；这些质谱原始数据经过数据库检索，可得到蛋白质的定性和相对定量信息。结果图如下：
结果文件说明
原始下机的质谱数据格式为.raw文件，查看需要专门的软件如Thermo xcalibur。由于原始数据不能被肽段图谱打分软件识别，所以质谱文件需要转化为mgf格式才能使用，进行后续的搜库、鉴定工作。
结果文件为mgf格式，示例如下：
其中每个结构如下：
BEGIN IONS：表示一个谱图的起点
TITLE：每个谱图的编号
CHARGE：母离子所带电荷数
RTINSECONDS：保留时间
PEPMASS：母离子质荷比
之后每一列为肽段经碎裂后的子离子质荷比和强度信息
END IONS：表示一个谱图的结束位置
参考文献：
Jiaming,Li. et al. TMTpro reagents: a set of isobaric labeling mass tags enables simultaneous proteome-wide measurements across 16 samples. Nature Methods( 2020).
作者：angelica
审稿：童蒙
编辑：amethyst
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