Sam/Bam文件格式详解
随着生物信息数据的爆发式增长，存储生物信息的文件格式也多样化起来，不同的文件格式往往有不同的目的：
为了软件之间的兼容性；
人类可读的用于数据加工、解析和处理的格式，比如.tsv,.csv等；
为了提高计算机计算效率的数据格式，一般可读性不强的二进制文件，比如今天要讲解到的bam文件。
介绍
Header section
Alignments section
01
Header section
该部分全部以“@”开头，提供基本的软件版本，参考序列信息，排序信息等 @HD行：这一行中有各种不同的标识 标识“VN”用以说明格式版本 标识“SO”用以说明比对排序的情况，有unknown (default)、unsorted、queryname和coordinate,对于coordinate，排序的主键是Alignments section的第三列“RNAME”，其顺序由@SQ行的“SN”标识的顺序定义，次要排序键是Alignments section的第四列“POS”字段。对于RNAME和POS相等的比对，排列顺序则是任意的 @SQ行的“SN”标签是参考序列说明，它的值主要是用于Alignments section的第三列“RNAME”和第七列“MRNM”比对的记录 @PG行是使用的程序说明；该行“ID”为程序记录标识符，“PN”为程序名字，“CL”为命令行 @CO行是任意的说明信息
02
Alignments section
该部分包含了11列必需字段，无效或者没有的字段一般用“0”或者“*”表示。
下面，以数据详细介绍下bam文件的Alignments section中的每一列的含义。
下图是reads比对情况的示意图
Coor是参考基因组上的位置坐标
ref为参考序列
+r001/1和-r001/2组成1对Reads
+r003和-r003是反向互补关系，其实是一条read
+r002、+r003和+r004都是单条read比对
下图是将比对情况记录成bam文件格式的样子
第1列：Qname
Read的名字
第2列：FLAG
每一个read的比对情况可以用十进制数字（或者十六进制数字）表示，如果比对情况 有多个，将多个比对情况所代表的十进制数字加和就是这一行的FLAG。比如，图1中r001的FLAG是99（1+2+32+64），则表示了“该read是pair read中的一个”，“pair read中每个都能够正确比对上”，“该read的mate read的反向互补可以比对上”，“该read是pari read中的read1”；r001的另一个FLAG是147（1+2+16+128），则表示“该read是pair read中的一个”，“pair read中每个都能够正确比对上”，“该read是原read的反向互补”，“该read是pari read中的read2”（也就是说，该read是read2的反向互补序列）。值得注意的是，r001是pair read，而且都能比对上，所以r001出现了两次，如果r001的read1比对到参考序列的2个地方，r001的名字则会出现三次；如果read1比对上一次，read2没有比对上，r001仍会出现2次，不过，其中一个r001的第三列为“*”；所以pair-end测序，read1文件和read2文件同时mapping，相同reads的id最少出现2次。另，以下网站可以通过输入FLAG值，直接找出该FLAG是那些FLAG的加和：Decoding SAM flags（https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html）第3列：RNAME
比对上的参考序列的名字，该名字出现在Header section的@SQ行的SN标识中，如果该read没有比对上，也就是说该read在参考序列上没有坐标，那么这一列则用“*”表示，那么这一行的POS和CIGAR列也会是“*”。第4列：POS
read比对到的参考序列“RNAME”最左侧的位置坐标，也是CIGAR中第一个比对标识“M”对应的最左侧碱基在参考序列的位置，未比对上的read在参考序列中没有坐标，此列标识为“0”。第5列：MAPQ
比对的质量值，计算方法为比对错误率的-10*log10的值，一般是四舍五入的整数值，如果是255，说明该比对值无效。第6列：CIGAR
CIGAR标识符表示read中每个碱基的比对情况，主要有以下标识符：
M: alignment match (can be a sequence match or mismatch)
read上的碱基与参考序列“RNAME”完全匹配，碱基一一对应，包括了正确匹配与错误匹配
I: insertion to the reference
read上的碱基相对于参考序列“RNAME”有插入现象（如下）：
REF: CACGATCA**GACCGATACGTCCGA
READ1: CGATCAGAGACCGATA
CIGAR：6M2I8M
D: deletion from the reference
read上的碱基相对于参考序列“RNAME”有删除现象（如下）：
REF: AGCTAGCATCGTGTCGCCCGTCTAGCATACGC
READ: GTGTAACC-GACTAG
CIGAR：8M1D6M
N: skipped region from the reference
read上的碱基相对于参考序列“RNAME”存在连续没有比对上的空缺，这些空缺用N来表示，跟“D”相似但远比“D”缺失的更多，这种比对类型也叫“Spliced alignment”，常见cDNA与参考序列比对（如下）:"…"表示intron
REF:AGCATCGTGTCGCCCGTCTAGCATACGCATGATCGACTGTCAGCTAGTCAGACTA
READ: GTGTAACCC................................TCAGAATA
CIGAR：9M32N8M
S: soft clipping (clipped sequences present in SEQ)
H: hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ)
read的开头或者结尾部分没有比对到参考序列"RNAME”上，但这部分未比对上的连续序列仍保留在sam文件的该read序列中，用“S”来表示；如果未保留，则用“H”表示，也即“hard cliping”（如下所示，也可同图2中r003的比对CIGAR中看出）
REF: AGCTAGCATCGTGTCGCCCGTCTAGCATACGCAT
READ: gggGTGTAACC-GACTAGgggg
CIGAR：3S8M1D6M4S （在sam中存储为GGGGTGTAACCGACTAGGGGG）
CIGAR：3H8M1D6M4H （在sam中存储为GTGTAACCGACTAG）
P: padding (silent deletion from padded reference)
多条read比对到参考序列的同一位置时，如果不同read单独同该参考序列比对时，参考序列的情况也不同，比如下方READ1同参考序列比对时，“GA”属于插入（6M2I8M），READ2同参考序列比对时，“A”属于插入（4M1I9M ），READ3同参考序列完全匹配（10M），没有插入，但是三条read之前却没有可比性。因此，当参考序列“比对情况包含完整”且序列唯一时，所有read同时进行比对，read3这种原本没有插入却默认插入的比对称之为Padded alignment，这种情况用“P”表示。
REF: CACGATCA**GACCGATACGTCCGA
READ1: CGATCAGAGACCGATA
READ2: ATCA*AGACCGATAC
READ3: GATCA**GACCG
The padded CIGAR are different:
READ1: 6M2I8M
READ2: 4M1P1I9M
READ3: 5M2P5M
=：sequence match 正确匹配
X：sequence mismatch 错误匹配
第7列：MRNM
该read的mate read比对上的参考序列的名字，该名字出现在Header section的@SQ行的SN标识中，如果和该read所在行的第三列“RNAME”一样，则用“=”表示，说明这对read比对到了同一条参考序列上； 如果mate read没有比对上，第七列则用“*”表示； 如果这对read没有比对到同一条参考序列，那么这一列则是mate read所在行第三列的“RNAME”。
第8列：MPOS
该read的mate read比对到的参考序列“RNAME”最左侧的位置坐标，也是mate read CIGAR中第一个比对标识“M”对应的最左侧碱基在参考序列的位置，未比对上的read在参考序列中没有坐标，此列标识为“0”。第9列：ISIZE
表示pair read完全匹配到同一条参考序列时，两个read之间的长度，可简单理解为测序文库的长度。这个定义有两种情况（虚线表示未比对上的序列，即soft-clipped bases）：第一种情况如图4左所示，Read1和Read2比对到同一条参考序列，此时ISIZE即为Read2的最右侧比对坐标减去Read1最左侧比对坐标； 第二种情况如图4右所示，由于至今没有明确的定义和共识，因此ISIZE可以是TLEN#1，也可以是TLEN#2，视情况而定。
第10列：SEQ
存储的序列，没有存储，此列则用“*”标识。该序列的长度一定等于CIGAR标识中“M”，“I”，“S”，“=”，“X”标识的碱基长度之和。第11列：QUAL
序列的每个碱基对应一个碱基质量字符，每个碱基质量字符对应的ASCII码值减去33（Sanger Phred-33 质量值体系），即为该碱基的测序质量得分（Phred Quality Score）。不同Phred Quality Score代表不同的碱基测序错误率，如Phred Quality Score值为20和30分别表示碱基测序错误率为1%和0.1%。【参考资料】
Sam格式详解手册：http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
Sam格式相关文献：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2723002/
Sam格式的wiki介绍（着重介绍了比对类型）：https://davetang.org/wiki/tiki-index.php?page=SAM
Sam格式相关的博客：https://blog.csdn.net/genome_denovo/article/details/78712972
快速查询FLAG的网站：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
ASCII码对应表：https://snipcademy.com/binf/img/lessons/dna-file-formats/ascii.svg
关于测序质量体系的博客：https://blog.csdn.net/xxxxy314/article/details/48948891/
作者：麦茬道
审稿：童蒙
编辑：amethyst
往期回顾