眼到手到-IGV的高级实操
在使用高通量数据进行变异分析时，经常使用IGV对变异进行可视化展示，可常常是眼到手不到，明明文章中有类似结果，自己却做不出来，这里为大家整理一些IGV的高级操作，供大家参考。
既然是高级操作，那些常规的操作，我们这里直接忽略。如果在实际使用中，遇到了以下问题，请继续阅读。
网络不给力，不能加载在线参考基因组；
比对文件bam过大，电脑打不开，直接卡死；
查看的样本数目过多或者覆盖深度较大，不能全部展示截取；
多个变异需要查看，能否批量产出。
01
无法加载在线参考基因组
在实际使用IGV中，经常需要在线下载相应基因组版本的信息，例如人的参考基因组hg19版本的下载地址为：http://s3.amazonaws.com/igv.broadinstitute.org/genomes/hg19.genome，而这个网站又经常不给力，导致加载失败，无法使用IGV。
当然如果使用始终使用同一套基因组版本，只要成功加载一次，后续一般就不需要每次都下载了。但凡中间更换过一次，就又需要重新下载。
有没有一劳永逸的方法，不用每次都等待加载？
方法1：保存下载文件并手动加载
在网络好的情况下，或者通过其他途径获得genome文件（例如hg19.genome），然后保存下来，每次启动IGV后，取消在线加载，变为手动加载已经下载的genome文件。
方法2：构建本地参考基因组
如果网络实在不给力，下载不到genome文件，那就构建自己的参考基因组。
01
选择构建基因组
选择菜单栏“Genome”下拉菜单中“Create .genome File”。
02
准备文件
在弹出的对话框中填写命名信息
Unique identifier：名称，自己随意定义一个名称即可，该名称会显示在菜单栏下的框中表示当前的基因组版本。
Description name：描述信息，自己定义即可
FASTA file：参考基因组的fasta文件，要求排序过，并且在同一路径下有对应的fai文件。
例如参考基因组为ucsc.hg19.fasta，对应的fai文件为ucsc.hg19.fasta.fai。该fai文件的构建方法为samtools faidx input.fa。
Cytoband file：染色体核型文件，与ANNOVAR输入文件相同，可以直接引用，可以从ucsc下载得到。格式为：
chr1 0 2300000 p36.33 gneg
chr1 2300000 5400000 p36.32 gpos25
chr1 5400000 7200000 p36.31 gneg
Gene file：基因信息文件，与ANNOVAR的输入文件相同，可以直接引用。格式为：
chr1 stdin transcript 11874 14409 . + . gene_id "DDX11L1"; transcript_id "NR_046018"; gene_name "DDX11L1"; gene_biotype "lncRNA";
chr1 stdin exon 11874 12227 . + . gene_id "DDX11L1"; transcript_id "NR_046018"; exon_number "1"; exon_id "NR_046018.1"; gene_name "DDX11L1"; gene_biotype "lncRNA";
Alias file：别名文件，可以不提供
03
保存构建的文件
填写后保存为genome文件，之后再用IGV的时候就可以直接使用了，不用加载在线的文件了。
04
测试bam查看结果
将bam或者tdf文件拖入或者导入IGV查看，与在线加载的genome结果相同（上图为自建基因组文件结果，下图为在线基因组文件结果），完成。
02
文件太大无法加载
在使用IGV时，有时文件过大，例如长度超过10kb乃至1Mb以上的SV，使用自己的电脑打不开，主要原因是内存不足。怎么办？总不至于为了一个变异位点，买个内存条吧！这里我们可以换个思路，我们使用IGV的主要目标是直观的确认变异，即使在文件时，我们参考的主要指标也是bam文件的coverage信息，所以这里我们可以直接提取coverage的信息，然后进行IGV查看。
包括coverage信息的文件格式为tdf文件，这个文件可以由以下命令获得（Linux命令）：
igvtools count -z 7 -w 10 test.target.bam test.tdf hg19.chrom.sizes
文件说明：
test.target.bam，为输入的目标区域的bam文件；
test.tdf，为输出目标区域tdf文件；
hg19.chrom.sizes，为参考基因组的各染色体长度，如果安装的igvtools的参考基因组自带该文件，可以用hg19代替。
参数说明：
-z 最大压缩级别，数字越大，得到的文件越小；
-w 窗口大小，以窗口为单位计算覆盖度，数值越大，分辨率越大，得到的文件越小。
文件大小前后也发生了很大改变，例如67M的bam文件转换为tdf后大小为1.8M，此时再用IGV就可以轻松查看了。
03
截取完整变异图谱
此外，使用IGV经常遇到的另外一个问题是，截取完整的reads图，而IGV的本身另存为的图像只能截取当前视图中的图像，当前隐藏看不到的，保存的图像里面也没有。当然，老司机也可以使用右击菜单中Squished功能，但是这里说的是即使压缩后依然不能显示全的情况，怎么办？
解决方法
选择“Tools”中的“Run Batch Script”，这里就需要我们编写一个脚本，然后通过调用这个脚本实现。
脚本很简单，两行命令，两个参数。maxPanelHeight，调整图形大小，根据实际需要调整，数值越大，截取的图形越高；snapshot，截图图形命名。注意，保存的图形默认保存着IGV的安装路径下。
maxPanelHeight 10000
snapshot test.png
运行后，这次得到的变异结果图形是不是够全。
04
批量制图
有时候变异位点比较多，单个的加载查看，耗时耗钱耗视力，怎么办？
可以使用脚本半自动批量实现呀，具体操作如下。
01
提取目标区域的比对结果
这里我们建议将目标区域的比对结果提取到一个bam文件中，手动加载到IGV，就可以批量定位目标区域并截图，提取比对结果的命令如下（Linux命令）：
samtools view -hb -L target_region.bed sample.sort.bam > target_region.sort.bam
samtools index target_region.sort.bam
02
生成目标区域的bedGraph
通常情况下，为了指示目标区域的变异，我们会按照目标区域的bed文件生成一个bedGraph文件，该文件可以用来提示目标变异的位置，在浏览变异截图时便于快速锁定目标变异，bedGraph文件示例如下。
track type=bedGraph name=Variant_info description=Variant_info maxHeightPixels=128:30:32 visibility=full autoScale=off viewLimits=0:10 color=0,0,255 altColor=255,0,0
chr9 114014318 114014318 10
chr7 96894731 96894973 10
03
加载bedGraph文件和bam文件
将文件直接拖进reads区域即可。
04
运行批量脚本
批量脚本在Windows系统中以.bat结尾，其内容如下：
maxPanelHeight 5000
goto chr7:96894700-96894998
sort position
snapshot chr7_96894733_96894970_DEL.png
goto chr9:114014278-114014357
sort position
snapshot chr9_114014317_114014317_INS.png
加载完bam和bedGraph文件后，选择“Tools”中“Run Batch Scripts”，选择编写的批量脚本。05
查看截图结果
截图结果，默认保存在IGV的安装的目录，例如C:\Program Files\IGV_2.8.7路径下。
截图中最上面蓝色的横条表示目标区域的变异，高低无意义，主要看左右两端的位置。
参考资料
IGV官网：http://www.igv.org/
IGV使用说明：https://software.broadinstitute.org/software/igv/book/export/html/37
作者：大行山
审稿：童蒙
编辑：amethyst
往期回顾
2、浅谈全基因组复制