人类早期胚胎发育DNA甲基化图景

表观遗传学—胚胎发育系列第1篇

DNA甲基化是一种基础且重要的表观修饰，本文系统的报道了人类早期胚胎发育的表观图景，为深入研究人类胚胎发育的表观遗传机制奠定了基础。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰在基因转录表达、基因印记的维持、X染色体失活和转座子元件的表达等一系列生物学过程中扮演重要的角色。

哺乳动物中最具有戏剧性的表观组变化发生在原始生殖细胞和胚胎植入前的发育过程。

为了获取人类早期胚胎的DNA甲基化图谱，作者使用全基因组简化甲基化测序（RRBS）和全基因组甲基化测序（WGBS）技术对人类配子和植入前后的 胚胎进行了研究。

实验材料

本研究使用的材料如下：

使用的材料为极体（polar body）、成熟卵母细胞（oocytes）和第一极体、合子（zygotes）、 2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚（morula）、内细胞团（inner cell mass，ICM）和囊胚阶段的滋养层细胞（trophectoderm cells，TE），此外还有精细胞。

不同细胞类型的聚类图

不同类型细胞的DNA甲基化水平聚类显示，不同类型细胞间有各自独特的甲基化特征。

例如：极体和卵母细间的甲基化状态相似，而与其他类型细胞差别较大；精细胞甲基化状态与其他类型细胞有明显的区别；2细胞-TE发育过程中甲基化状态变化比较平稳。

基因区域甲基化水平分布

在基因体（gene body）层面和不同发育阶段层面，不同类型、发育时期细胞的甲基化转态变化明显。

左图：可见在转录起始位点（TSS）和转录终止位点（TES），这两个转录起始和终止的关键位点，其甲基化水平有着非常典型的特性，尤其是TSS附近甲基化水平极低且gene body内部比其侧翼区域的甲基化水平稍高；植入后胚胎、精细胞、卵母细胞、合子作为发育晚期和独立细胞，其在基因层面的甲基化水平与2细胞-ICM发育阶段细胞的甲基化状态存在较大区别 ；

右图：体现了不同发育阶段的动态甲基化水平变化，原始细胞存在一定的甲基化水平来维持功能，在随后形成合子和发育过程中合子的甲基化水平被擦除，此时生物学过程无比活跃，直至形成ICM达到最低，最后植入胚胎前后才完成重建和稳定。

不同时期不同区域的甲基化

水平变化情况

小鼠中甲基化擦除主要发生在合子-2细胞过程，而人类胚胎发育中去甲基化和甲基化重建又有什么特点呢？不同的基因组区域的甲基化水平变化是否同步？

对不同CpG含量的启动子（HCP、ICP、LCP）、CpG岛（CGI）、外显子（Exon）、内含子（Intron）、基因（Intragenic）、基因间区（Intergenic）、转座子元件（细分为SINE、LINE、LTR）和增强子（Enhancer）的甲基化水平进行计算，绘制动态发育过程甲基化水平的变化。

结果发现，整体上不同基因组区域的甲基化动态变化相似，说明胚胎发育过程中全基因组的甲基化变化趋势一致，是一个统一的过程。但也能发现高CpG的区域如CGI和HCP一直是去甲基化状态且甲基化水平相对稳定。

极体之间的比较

此外，对第1极体和第2极体的甲基化水平进行比较，二者从卵母细胞取出的过程是对甲基化状态产生了影响以及二者是否本身就存在较大的甲基化水平的差异。

结果发现，第1、2极体和卵母细胞的甲基化水平差别不大，说明从卵母细胞中挤压出极体的过程中没有产生全基因组甲基化的非对称性。

卵母细胞甲基化水平分布

有文献报道小鼠中卵母细胞中non-CpG的DNA甲基化水平，而人类卵母细胞尚未有相关报道。

绘制gene body侧翼non-CpG甲基化曲线发现，non-CpG甲基化水平较低，gene body的甲基化水平明显高于侧翼，且整体分布形态和CpG甲基化模式相似。

不同类型胞嘧啶的甲基化水平存在差异那么，DNA甲基化水平和胞嘧啶的密度是否存在关系？

以CpG类型为例，对不同细胞类型样本的胞嘧啶密度和甲基化水平的关系进行绘制（左图为高/中等甲基化水平，右图为低甲基化水平）

结果发现富含CpG的基因组区域甲基化水平偏低，反之偏高。这可能与CpG岛低甲基化相关。

亲本溯源的甲基化动态变化

胚胎发育过程中甲基化发生了剧烈的变化，那么去甲基化的过程中父源和母源基因组的甲基化动态如何呢？

使用单细胞RRBS技术对分离出的父源、母源的原核进行测序，并分析了DNA甲基化水平的动态变化。

可见，父源和母源的原核的甲基化动态变化非常的剧烈且并不一致。配子阶段精细胞甲基化水平较卵母细胞稍高，显微注射后的数十个小时里发生了较大的变化，父源和母源原核甲基化水平迅速下降，父源的去甲基化程度更大，最终父源的甲基化水平比母源的要低形成反转，免疫荧光染色也证实了这一点。

差异甲基化区域分析

接下来，对精细胞和卵母细胞的甲基化相似性和差异性进行了分析。使用固定长度区域（100bp）来计算全基因组的tile甲基化水平，并分别对高甲基化（≥75%）和低甲基化（≤25%）区域进行分析。

左图为卵母细胞和精细胞中均高甲基化tile和其他细胞类型样本甲基化水平的分布；右图为卵母细胞和精细胞中均低甲基化tile和其他细胞类型样本甲基化水平的分布。卵母细胞和精细胞间有64.3%的tile的甲基化水平相似。

分析高甲基化和低甲基化区域的分布特点发现，高甲基化区域显著富集于SINE和LINE等转座子元件，用于抑制转座元件的转录活性。而低甲基化区域富集于HCP、增强子、外显子和CpG岛，用于维持胚胎发育。

此外，还对卵母细胞和精细胞间的差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMR）进行了研究，分别鉴定出了17,473个精细胞特异的DMRs和12,145个卵母细胞特异的DMRs。

左图为卵母细胞特异的DMRs，右图为精细胞特异的DMRs。

精细胞DMRs相对富集与基因间区，而卵母细胞富集于基因内部。相较于卵母细胞而言，精细胞特异的强烈富集于组织特异的被H3K4me1标记的增强子区域；  精细胞倾向于超甲基化增强子元件说明，精细胞需要维持发育过程中的稳定性，而卵母细胞位于CGIs的频率比精细胞要高。

甲基化与组蛋白修饰

接下来，对DNA甲基化与组蛋白修饰间的关系进行了探讨。

结果发现，胚胎干细胞和ICM阶段H3K27me3区域通常富含低水平的DNA甲基化，配子和中间的发育阶段同样存在低甲基化的现象。

而当比较启动子的DNA甲基化水平与H3K27me3富集程度时发现，二者呈现负相关性。说明，多能性的ICM、DNA甲基化和H3K27me3修饰和不同的靶基因集有关。

甲基化与基因表达的关系

随后，对基因表达和DNA甲基化间的关系进行探讨。

分别对基因体和启动子的甲基化水平与基因表达量间的相关性进行了计算，结果发现，基因和启动子的 甲基化水平与基因的表达量呈负相关的关系，且发育后期的负相关性越来越高。这说明，在DNA甲基化的擦除和重建的各个阶段，启动子的DNA甲基化仍然会抑制相关基因的表达。

甲基化与重复序列的关系

最后，对DNA甲基化是如何抑制转座子元件的机制进行了探讨。以常见的长散在重复序列（LINE）和短散在重复序列（SINE）进行了探讨。

在不同发育阶段，重复元件的表达与DNA甲基化的区域呈现负相关。胚胎发育早期DNA甲基化被擦除，重复元件的表达水平提升，后期DNA甲基化水平重建重复元件的表达水平被强烈抑制，维持较低的水平（图a，c）。此外，Alu、MIR、L1和L2的平均甲基化水平符合全基因组甲基化水平的变化。

总结

本文对人类早期胚胎不同发育阶段样本的DNA甲基化水平进行了探讨，对DNA甲基化、组蛋白修饰、基因表达和转座子元件间的关系进行了研究。

人类早期胚胎发育的各个阶段全基因组的甲基化水平发生了剧烈的变化，发生了从去甲基化到甲基化重建的过程；不同发育阶段的细胞有其特有的差异甲基化区域；DNA甲基化与不类型的组蛋白修饰有完全不同的相关性，说DNA甲基化和不同类型的组蛋白修饰各自调控着一套基因集；转座子元件和DNA甲基化关系也十分密切，同样经历了擦除和重建的过程；另外，DNA甲基化的状态同时影响了基因的表达，尤其是发育后期启动子区域的甲基化与基因表达的负相关性明显增强。

总之，该文系统的研究了人类早期胚胎发育不同阶段的DNA甲基化情况，首次展示了人类早期胚胎的表观图景，为以后深入研究胚胎发育机制奠定了基础。

参考资料

The DNA methylation landscape of human early embryos. NATURE. 2014. doi:10.1038/nature13544

作者：马可菠萝

审稿：童蒙

编辑：angelica

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