Nature：基因组中的“暗物质”与乳腺癌的发生丨BioArt国科大论坛

BioArt按：6月24日，BioArt推出“国科大论坛”专栏，旨在鼓励中国科学院大学（UCAS）生命学院的优秀本科生接触学术最前沿，激发他们对生命科学某些领域深层次的理解，同时也锻炼他们对科学报道的写作能力。今日BioArt推出第四篇系列文章，这篇文章解读的是近日来自MIT和哈佛的Broad Institute的科学家以长文形式（Article）在Nature杂志上发表题为“Recurrent and functional regulatory mutations in breast cancer”的研究论文，揭示了基因组上非编码区某些位点的突变对乳腺癌发生的影响。

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撰文丨张心怡（中国科学院大学2014级本科生）

摘要

随着对于肿瘤的基因组分析的开展，数百个位于蛋白质编码区的癌症基因已被定位。然而，我们却对非编码区中能引发癌症的突变所知甚少。麻省理工学院和哈佛大学的布罗德研究所与马萨诸塞州综合医院癌症研究中心合作，2017年6月28日在Nature杂志上发表了题为” Recurrent and functional regulatory mutations in breast cancer”的文章，基于对360例原发性乳腺癌的深度测序，在三个基因FOXA1、RMRP和NEAT1的启动子上检测到了显著突变。研究表明，启动子区域包含着能够引起蛋白质功能变化的突变，突变频率与编码区突变相似。功效分析显示，通过对足够大的患者群体的深度测序，还可以检测到更多的类似非编码区突变。

背景介绍

在肿瘤基因图谱(TCGA)和国际癌症基因组联盟(ICGC)大规模的肿瘤基因组测序数据中，已在体细胞中检测出数百个潜在的癌症驱动基因。然而，由于这些研究中使用的肿瘤样品在种类和数量上都比较少，为保证统计功效，只能检验出部分突变[1]。为了更加有效地研究编码区和调控区的突变，研究人员开发了一种新的捕获外显子、启动子和其他调控区域基因的方法，将其应用于360例原发性乳腺癌的肿瘤细胞和正常组织进行基因组对比，在目标区域测序深度达到了平均80×。此方法在患者的体细胞中应用，测得的突变率与已有的研究相符，证明了此方法的可靠性。本研究在患者群体中对驱动基因进行类似的全方位分析，着重关注位于启动子区域的非编码突变（转录起始位点上游400bp和下游250bp之间）。

文章解读

为了找到基因组中容易发生突变的区域，需要对相应区域进行仔细的背景突变频率分析。背景分析需要考虑的因素包括（1）患者所测的基因组覆盖信息；（2）患者基因组的总体突变频率；（3）突变率在基因组水平上的变化；（4）突变成簇出现[2]。考虑了以上的背景因素之后，研究人员在基因组中寻找具有以下特点的启动子（1）具有比期望值大很多的突变频率或（2）有异常的突变成簇聚集现象。考虑到部分乳腺癌肿瘤对于APOBEC(apolipoprotein B messenger RNA-editing enzyme catalytic)介导的诱变过程表现出很高的活性[3]，研究人员也剔除了这部分样品数据。

通过以上的研究分析，研究者寻找到了9个突变相关的启动子，它们分别与FOXA1(已确认的癌症基因)、TBC1D12、RMRP/CCDC107(双向启动子)、NEAT1、LEPROTL1、ALDOA、ZNF143、CITED2和CTNNB九个基因相关联（图1 a）。将发生了突变的这9个启动子区域进行重新测序，其中大多数的突变都有很高的测序深度和接近100 %的检测灵敏度，只有FOXA1的启动子中有一个复发性的单碱基突变热点测序深度非常低，并且只有33%的检测灵敏度（图1 b）。FOXA1上发生的11个突变中的9个都发生在这个突变热点上。部分其他基因的启动子区域也发现了突变热点，研究人员在基因上对突变热点进行了定位。接下来，研究人员在已经发表的乳腺癌基因组上验证这些突变热点的可靠性，都得到了可靠的数据支持。

图1 显著突变的启动子

将这些突变热点与不同类型的乳腺癌进行比对分析，FOXA1 和ZNF143突变主要发生在雌激素受体（ER）阳性乳腺癌中；ZNF143、ALDOA 、LEPROTL1 和TBC1D12突变则与Luminal B型乳腺癌相关。

接下来的两个实验检测了这些启动子的突变是否产生了功能性后果：（1）在HEK293T细胞中用荧光素酶报告基因检测突变对基因表达的影响；（2）用电泳迁移率实验（EMSA）分析野生型和突变型启动子之间蛋白结合率的变化。FOXA1 和 RMRP中的突变导致转录因子募集作用的增强（图2 a,b），同先验知识相一致：FOXA1是已知的癌症基因；RMRP是参与核糖体RNA加工的非编码RNA，在转录调节中起重要作用。相反，NEAT1中的突变与野生型相比则降低了蛋白结合率，与功能缺失的表型相一致（图2 c）。

图2 启动子突变的功能特性

然后，研究人员对FOXA1启动子区域突变的具体功能进行了研究。蛋白结构分析显示，突变可能导致E2F转录结合的增强。四个实验分别验证了这个猜测：（1）电泳迁移率实验中，竞争性的E2F强亲和力DNA片段能有效阻碍野生型和突变型DNA探针结合E2F；（2）E2F3和其辅助因子DP1的共表达能提高启动子的活性，在突变型中这种提高更显著；（3）pull-down实验中，突变型与E2F1 /E2F3和DP1的结合力明显增强；（4）结合E2F1染色质免疫共沉淀法和CHIP-seq分析MCF-7乳腺癌细胞，突变型中一段包含突变热点的6bp片段表现出很强的亲和力。

用雌激素受体拮抗剂氟化合物（治疗激素受体阳性乳腺癌的复合物）处理过量表达FOXA1的MCF-7乳腺癌细胞，细胞生长速度明显增快。这表明，FOXA1水平升高使细胞对ER的耐药性提高。

然而，对于FOXA1基因上的突变发生的具体位置表明，不同类型的FOXA1突变产生的结果不完全相同， 有待进一步的研究。

现有的研究不能够检测出非编码区的突变的原因是，检测出非编码突变需要很高的测序深度和足够大的群体以达到统计上的显著性。许多启动子GC含量高，导致测序覆盖率低，对这些区域的研究提出了特殊的挑战。即使该研究中检测灵敏度已经比较高了，但由于目标设计和测序覆盖率问题，仍只检测出了44%的启动子突变，有更多的启动子区域突变有待发现。

讨论与总结

研究人员在360个原发性乳腺癌的患者群体中进行了启动子的全面分析，定位了 9个启动子显著性突变的基因。有强有力的实验证据证明，其中3个基因(FOXA1、RMRP和NEAT1)启动子的突变对转录过程有显著的影响。多个实验证明FOXA1启动子对基因表达有实质性的影响，高水平的FOXA1蛋白可以增加细胞对雌激素的敏感性[4]，但近来，高水平的FOXA1表现出不良的临床反应，使细胞对氟维司群（抗肿瘤药）反应减弱，抗性增强[5]。因此，对于正在接受激素治疗的患者来说，检测FOXA1的变化可能成为肿瘤治疗的重要步骤。

适当的癌症治疗要求正确地识别患者所有的重要功能性突变，不论是编码区突变还是调节区域的突变。检测这些调节区域的突变需要对数量很大的群体进行系统分析和实验验证。启动子的突变可能可以解释未发生突变的癌症基因的激活或失活，也可能有助于发现新的癌症基因。完善对肿瘤基因的编码区和非编码区突变的理解将成为癌症精准医学的基础。

值得一提的是，这篇文章发表的同时，Nature杂志还配发了来自耶鲁大学Mark Gerstein教授撰写的评论文章“Cancer genomics: Less is more in the hunt for driver mutations”，对上述工作给予了高度评价（下图）。

参考文献：

1. Weinhold, N., et al., Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet, 2014. 46(11): p. 1160-5.

2. Lawrence, M.S., et al., Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature, 2013. 499(7457): p. 214-8.

3. Nik-Zainal, S., et al., Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers. Cell, 2012. 149(5): p. 979-93.

4. Badve, S., et al., FOXA1 expression in breast cancer--correlation with luminal subtype A and survival. Clin Cancer Res, 2007. 13(15 Pt 1): p. 4415-21.

5. Jeselsohn, R., et al., TransCONFIRM: Identification of a Genetic Signature of Response to Fulvestrant in Advanced Hormone Receptor-Positive Breast Cancer. Clin Cancer Res, 2016. 22(23): p. 5755-5764.

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