颜宁组Cell报道电鳗NaV1.4-β1复合体近原子分辨率结构丨BioArt特别推荐

BioArt按：由于钠离子通道的异常会导致诸如痛觉失常、癫痫、心率失常等一系列神经和心血管疾病，并且很多已知的包括蝎毒、蛇毒、河鲀毒素在内的生物毒素以及临床上广泛应用的麻醉剂等小分子均通过直接作用于钠通道发挥作用。因此，钠通道是诸多国际大制药公司研究的重要靶点，其结构为学术界和制药界共同关注。7月20日，清华大学结构生物学高精尖创新中心颜宁教授领导的团队在Cell杂志上发表了题为“Structure of the Nav1.4-β1 Complex from Electric Eel”的论文，首次报道了带有辅助性亚基的真核生物电压门控钠离子通道复合体4.0埃的结构，并提出了钠离子通道快速失活（fast inactivation）的变构阻滞机制（allosteric blocking mechanism）。

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论文解读：

撰文丨姜易昊（美国威斯康星大学麦迪逊分校Baron Chanda课题组博士生）

自从列文虎克（Antonie van Leeuwenhoek）用自制的显微镜观察到单细胞以来，人们就意识到在细胞与环境之间有一层膜将其隔绝开来以保证细胞内的生化反应能够规律的发生。然而疏水的磷脂双层隔绝了细胞与环境之间自由的离子交换，而离子通道很好的解决了这个矛盾。离子通道有许多种门控方式，包括电压门控制（voltage-gated），配体控制 (ligand-gated)，机械控制(mechanosensitive)等等。

在1952年，Hodgkin和Huxley发表了离子通道研究的里程碑工作。他们的研究指出，细胞膜对钠钾离子通透性的改变是产生动作电位的关键，并因此与Sir John Carew Eccles分享了1963年诺贝尔生理与医学奖。而在去极化的膜电位下，钠离子通过电压门控钠离子通道流入细胞内是动作电位起始及传递的关键【2，3，4，5，6】。在1998年，Roderick MacKinnon领导的课题组用X射线晶体衍射解出了钾离子通道蛋白结构，并因此与Peter Agre分享了2003年诺贝尔化学奖（下图）【1，7】。相应的电压门控钠离子通道蛋白的结构也是炽手可热的课题，是世界各地众多结构生物学课题组所注目的焦点。

真核电压门控钠离子通道与原核的有很大不同，它包括α和β两种亚基。α亚基由一条单肽链折叠而成，包含4个相似的重复折叠形成假四聚体，这也是与原核电压门控钠离子通道最大的区别之一（原核的钠离子通道和钾离子通道比较类似，都是由相同的一个单体组成同源四聚体，每一个单体等同于真核钠离子通道的一个重复折叠）。每个折叠都有6个跨膜螺旋（分别简称为S1-S6），其中S1-S4是电压感受区，包含特征性重复出现的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）而带有正电；四个重复折叠中的S5和S6共同组成离子通道。因为α亚基中四个重复折叠的氨基酸序列不完全相同，因此真核钠离子通道各个折叠的电压感受官能团移动具有不同时性，并且离子通道也是不对称的，相应的其快失活的机制也无法用原核的结构进行解释。而β亚基在原核钠离子通道中不存在，在真核中它起到辅助调节α亚基的作用。β亚基可以调控真核钠离子通道的表达量，细胞器之间的转运以及通道的电生理特性（激活，失活）等。通常β亚基由一个免疫球蛋白形状的N端和一个相连的单跨膜螺旋组成，只有β1B是例外地只有一个可溶的免疫球蛋白状的N端。除此之外，真核电压门控的药学性质及转录后修饰对其电生理特性的影响等等也有许多无法用原核结构解释的地方。

在人体中共有9种钠通道α亚型(分别命名为Nav1.1-1.9)，特异分布于神经和肌肉组织中。由于其重要的基本生理功能，钠通道的异常会导致诸如痛觉失常、癫痫、心率失常等一系列神经和心血管疾病。至今为止，已经发现了1000多种与疾病相关的钠通道突变体。另一方面，很多已知的包括蝎毒、蛇毒、河鲀毒素在内的生物毒素以及临床上广泛应用的麻醉剂等小分子均通过直接作用于钠通道发挥作用。钠通道是诸多国际大制药公司研究的重要靶点，其结构为学术界和制药界共同关注。

颜宁研究组十年来一直致力于电压门控离子通道的结构生物学研究，取得了一系列重要成果，包括来自细菌中的钠通道NavRh的晶体结构 (Zhang et al., 2012)。而近两年更是相继报道了与钠离子通道有同源性的世界上首个真核电压门控钙离子通道复合物Cav1.1 (Wu et al., 2016; Wu et al., 2015)以及今年3月3日该课题组在Science发表了题为“Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution”的论文， 报道了首个真核钠通道NavPaS (Shen et al., 2017)的高分辨率冷冻电镜结构，为理解真核电压门控离子通道的结构与功能提供了重要基础，同时也为药物研发及病理阐释做出了巨大的贡献。之前虽然有许多原核的钠离子通道结构被解出，如NavAb, NavRh等，然而作为第一个近原子分辨率的真核电压门控钠离子通道，NavPaS具有举足轻重的意义【8，9，10】。

可是NavPaS的结构仍有许多不足之处。首先，NavPaS的电生理特性因其在异源表达系统下无法被记录而仍是空白；其次，在快失活（fast inactivation）中起到关键作用的的官能序列（motif）Ile/Phe/Met (IFM) 被换成了 Ala/Thr/Asp，所以很可能NavPaS并没有快失活的电生理特性【9】。综上所述，一个电生理特性完备，并与人源电压门控钠离子通道更相近的结构就显得异常重要。

最新发表的这篇文章所报道的电鳗（Electric Eel）EeNav1.4，是历史上首个被纯化并被克隆的钠通道，是钠通道功能研究的重要模型。它的电生理特性经由多个实验组分别报道过，并在与人源的电压门控钠离子通道氨基酸序列对比后，发现其与Nav1.4最为接近。该研究解出了适合电生理研究的电压门控钠离子通道蛋白与β1结合的结构。为进一步厘清钠离子通道快失活的分子机理，及β1亚基如何调节α亚基功能提供了结构基础。

电压门控钠离子通道Nav1.4-β1复合物结构示意图

这次解出的结构在第三第四重叠的跨膜螺旋区分辨率很高，可以清楚地看到氨基酸侧链的位置，而在细胞内的N端及C端，分辨率很低，只能在低通过筛选图（low-pass-filtered map）中看到。与NavPaS相比，本文报道的结构，又得到了如下重要细节：

1. 这次观察到的EeNav1.4-β1复合物的结构是一个开通道的结构。这对于电压门控钠离子通道来说，是一个“奇迹”。因为冷冻电镜下的样品膜电位为0 mV，在这个条件下，电压门控钠离子通道应该处于被激活后的快速失活状态（通常激活态只延续几毫秒），不应该解出一个开放通道的结构。然而通过计算通道的半径在2埃以上，完全足够钠离子通过。而在电子密度图谱检查中，似乎有物质卡住通道，而导致解出开放通道的结构。

2. 通过比较EeNav1.4的开通道结构和NavPaS的闭通道结构，对于理解药物作用于重复折叠间的膜内开口（fenestration）的通道状态依赖性的分子机理有了更好的理解。

3. 通过比较EeNav1.4的开通道结构和NavPaS的闭通道结构，可以进一步猜测电偶联（electromechanical coupling）机理。S4在去极化膜电位下的移动，影响了相接的S4-S5环及毗邻的重复折叠中的S5跨膜螺旋，并多米诺骨牌效应般影响了离子通道。有了两个不同状态的比较可以更好地理解突变是如何影响电压控钠离子通道功能的，从而从分子层面理解病理。

4. β1亚基的整体结构就像一把斧子，胞外的免疫球蛋白官能团和跨膜螺旋分别是“斧头”和“斧柄”。而α亚基的重复折叠一的外环5和重复折叠四的外环6通过极性和静电作用分别像拇指和手掌一样与免疫球蛋白官能团相结合。而α亚基的重复折叠三的电压感受区S0和S2则通过疏水相互作用与“斧柄”相邻。

5. 通过分析α亚基重复折叠三和重复折叠四（因为分辨率更高）中S1-S4电压感受区的带正电荷侧链（赖氨酸与精氨酸）与其相对应的带负电侧链的相对位置，发现与0 mV的环境相符，他们的电压感受器都处于去极化（up）状态。

6. 通过观察在α亚基快速失活LFM官能序列（等同于Ile/Phe/Met (IFM) motif）空间位置结构，及其相互作用的结构和侧链，提出快速失活是LFM官能序列像楔子一样插入S4-S5 segments与S6之间，并通过异构化效应导致通道关闭，而非直接堵在离子通道的出口上。

诚然，一个结构的解出不仅仅会得出这些分子机制的阐释，其所蕴含的巨大信息量，使很多之前的猜想有了实验的方向，并为许多猜想及假说提供了结构基础。就像埃利亚的哲学家芝诺所说，“知识就好比一个圆圈，圆内是已知，圆外是未知。已知的越多，圆越大，所接触的未知也就越多”。希望电压门控钠离子通道蛋白领域的研究能随着面临的问题与未知而迸发出更多出色的研究成果。

据悉，颜宁教授为本文的通讯作者。结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫浈（医学院博士后）、医学院副研究员周强、生命学院博士生王琳、生命学院博士毕业生吴建平为本文的共同第一作者；清华大学冷冻电镜平台雷建林博士指导数据收集。本研究获得了清华大学冷冻电镜平台工作人员李小梅和李晓敏的大力支持。国家蛋白质科学中心（北京）清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为本研究的数据收集和数据处理提供了支持。北京市结构生物学高精尖创新中心、膜生物学国家重点实验室、科技部、基金委、生命科学联合中心-清华大学为本研究提供了经费支持。

参考文献：

1. Doyle, Declan A., et al. "The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity." science 280.5360 (1998): 69-77.

2. Hille, Bertil. Ion channels of excitable membranes. Vol. 507. Sunderland, MA: Sinauer, 2001.

3. Hodgkin, Allan L., and Andrew F. Huxley. "Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo." The Journal of physiology 116.4 (1952): 449-472. 

4. Hodgkin, A. L., and A. F. Huxley. "The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo." The Journal of physiology 116.4 (1952): 473-496.

5. Hodgkin, Allan L., and Andrew F. Huxley. "The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo." The Journal of physiology 116.4 (1952): 497-506.

6. Hodgkin, Alan L., and Andrew F. Huxley. "A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve." The Journal of physiology 117.4 (1952): 500-544. 

7. MacKinnon, Roderick, et al. "Structural conservation in prokaryotic and eukaryotic potassium channels." Science 280.5360 (1998): 106-109.

8. Payandeh, Jian, et al. "The crystal structure of a voltage-gated sodium channel." Nature 475.7356 (2011): 353.

9. Shen, Huaizong, et al. "Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution." Science 355.6328 (2017): eaal4326.

10. Zhang, Xu, et al. "Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel." Nature 486.7401 (2012): 130-134.

11、Wu, J. et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 A resolution. Nature 537, 191-196, doi:10.1038/nature19321 (2016).

12、Wu, J. P. et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 complex. Science 350, doi:ARTN aad2395

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闫浈博士代表性论文：

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