Nature：中美合作首次发现m6A修饰调控T细胞稳态【附专家点评】丨BioArt特别推荐
BioArt按：m6A （N6-methyladenosine，6-甲基腺苷酸）是真核生物mRNA中最常见的一种甲基化修饰，芝加哥大学何川教授首次证明m6A修饰可以被动态调控，暗示其可能具有重要的生理功能【1】。过去五年大量的实验表明，与DNA以及组蛋白的表观遗传修饰系统类似，m6A RNA表观遗传修饰系统也包括甲基转移酶（METTL3、METTL14等）、去甲基化酶（FTO、ALKBH5等）以及识别酶（YTHDC1、YTHDF2等）。此外，m6A修饰还参与调控mRNA代谢的全过程，特别是调控了mRNA的稳定性并且能够决定干细胞的分化【2-4】。Nature杂志最近半年还连续发文报道了m6A RNA修饰在斑马鱼和果蝇体内的功能【5-7】。辅助性T细胞是人体内重要的一类免疫细胞，在人体免疫监视和免疫防御过程中发挥重要作用。辅助性T细胞在不同的微环境作用下分化为不同的效应亚群，m6A是否参与调控辅助性T细胞的亚群分化和功能并不清楚。8月9日，Nature杂志在线发表了来自耶鲁大学Richard A. Flavell教授实验室和暨南大学尹芝南教授实验室合作的题为“m6A mRNA methylation controls T cell homeostasis by targeting IL-7/STAT5/SOCS pathway”的最新研究论文， 首次报道了m6A mRNA修饰在哺乳动物免疫细胞中的生理功能。该项研究发现，m6A通过靶向Naïve CD4 T细胞中IL-7/STAT5/SOCS信号通路中的信号分子mRNA来调控Naïve CD4 T细胞的分化，从而维持免疫系统的动态平衡。METTL3作为重要的甲基转移酶调控m6A RNA甲基化修饰，在CD4 T细胞中特异性敲除Mettl3基因，Naïve CD4 T细胞的分化受阻，从而抑制了T细胞过继转输诱导的肠炎模型中肠炎的发生。该项研究首次揭示了体内m6A甲基化修饰在T细胞介导的肠炎中的生理功能，为T细胞体内稳态和信号依赖的mRNA的降解提供了新的分子机制。鉴于该工作的重要意义，BioArt特别邀请了上海市免疫研究所的资深研究员李斌老师对该工作进行点评，以飨读者！
论文解读：
m6A （N6-腺苷甲基化修饰）是RNA中最丰富、分布最广泛的RNA修饰【2】。2011年，m6A RNA去甲基化酶FTO的发现【1】，让人们重新开始关注RNA甲基化修饰在生理上的作用。近期研究发现，在胚胎干细胞（ESC）中敲除m6A甲基化酶METTL3后，在诱导分化条件下，ESC仍持续高表达多潜能相关基因（Oct3/4、Nanog、Rex1），无法上调分化相关基因(Gata6、Sox1、Otx2等)的表达，使ESC一直处于多潜能化阶段【3,4】。与ESC分化类似，Naïve T细胞可在体内/外特定分化条件下分化为不同的T细胞亚群，但m6A在T细胞稳态和分化中的作用仍然未知。
在这项研究中，研究人员通过构建CD4-Cre Mettl3fl/fl条件性敲除小鼠（以下简称KO鼠）系统性地研究了N6-腺苷甲基化修饰调控T细胞稳态的分子机制。该研究发现，分选的Naïve CD4 T细胞在体外相应的细胞因子诱导下，KO小鼠来源的Naïve T细胞分化为Th1和Th17细胞的比例显著下降，分化为Th2细胞的比例显著上调，而Treg细胞比例几乎没有变化。且在将KO小鼠CD4+CD25-CD45RBhi naïve T细胞转输至RAG2-/-小鼠体内后，无法诱导小鼠慢性肠炎。对转输至RAG2-/-小鼠体内的细胞进行分析发现：1） KO小鼠Naive T细胞可在RAG2-/-小鼠体内长期存活（至少12周）；2） 转输的KO小鼠Naive T细胞无法进行稳态增殖和分化，始终维持Naive T细胞状态 (图1) 。
图1. Mettl3 KO Naive T细胞转输至RAG2-/-小鼠体内不会导致自发性肠炎（a），继续保持初始状态，无法进行稳态增殖（b）。
Naïve T细胞的稳态和存活主要受IL-7/STAT5和TCR信号通路共同调控【8】。因此，METTL3的敲除可能影响了IL-7R下游信号分子，从而影响了转输的T细胞的增殖和分化。为了验证这一猜想，分选的WT和KO小鼠的Naïve T细胞体外给予IL-7/IL-2或anti-CD3/CD28刺激，实验结果表明KO小鼠 Naive T细胞的IL-7信号通路下游的JAK1 和STAT5 磷酸化水平显著降低，而TCR下游信号分子ERK和AKT的本底磷酸化程度增强。进一步研究发现，KO小鼠 Naive T细胞中，一类细胞因子信号抑制分子（SOCS）家族的mRNA水平显著上调，这其中包括SOCS1、SOCS3、CISH，而这些蛋白是已知的IL-7信号抑制分子，其中SOCS1还可抑制Ras-GAP的活性, 从而促进ERK和AKT的磷酸化。上述结果揭示了为何KO小鼠 Naive T细胞无法稳态增殖却可以长期存活，同时也表明，m6A可靶向SOCS蛋白家族，调控IL-7和TCR信号通路，影响Naive T细胞的稳态增殖和分化。
有研究表明，大部分基因（~87%）的mRNA丰度的变化主要是由mRNA的转录速率决定的，但小部分基因（~13%）的mRNA丰度是由降解速率决定【9】。这一小部分基因主要为早期快速诱导基因，而SOCS家族的大部分成员属于IL-7刺激诱导的早期快速诱导基因。然而，T细胞中的m6A其如何选择性靶向SOCS蛋白家族呢？通过RNA降解试验以及全基因组测序的s4U-Seq试验发现: 1） IL-7可诱导SOCS mRNAs的快速降解，解除SOCS家族蛋白对IL-7受体信号通路的抑制作用，促进Naïve T细胞重编程（Reprogram）进而启动T细胞的增殖、分化；2）m6A介导了一类基因（包括SOCS 基因）mRNAs的快速降解（图2）。
图2. m6A控制T细胞稳态分布的分子机制。 a. Mettl3 KO 初始T细胞内的Socs基因表达升高阻止了IL-7诱导的激活；b.初始T细胞激活的新模型。
机体内T细胞的稳态为机体免疫监视和免疫防御提供了重要保障。该项研究首次揭示了体内m6A甲基化修饰在T细胞介导的肠炎中的生理功能，阐明了m6A甲基化修饰在调控辅助性T细胞的效应分化中的作用，为T细胞体内稳态和信号依赖的mRNA的降解提供了新的分子机制，并且表明m6A RNA修饰系统可以作为减轻自身免疫疾病的药物靶点。
据悉，该论文的通讯作者为耶鲁大学的Richard A. Flavell教授，李华兵博士及以及暨南大学的尹芝南教授。耶鲁大学Richard Flavell实验室的李华兵博士、暨南大学和耶鲁大学联合培养的尹芝南教授的博士生童吉宇、以及Richard Flavell实验室的朱书博士为这篇论文的共同第一作者。该工作的一部分受到了国家自然科学基金委重大国际合作项目和“111计划”的支持。这篇论文的共同第一作者朱书博士现已全职回到中国科学技术大学任教授。这篇论文的第一作者兼共同通讯作者李华兵博士目前已全职回到上海交通大学医学院上海市免疫学研究所组建独立实验室，继续开展m6A的后续相关工作。上海市免疫学研究所是由上海市科委、上海市教委和上海交通大学医学院共建的我国第一家从事免疫学研究的专门机构，近年来，在中组部/上海市“千人计划”专家、长江学者讲座教授、上海交通大学“王宽诚”讲席教授苏冰所长的带领下，已经成为中国的免疫学研究重镇。值得注意的是，苏冰教授是耶鲁大学博士，2012年全职归国前是耶鲁大学医学院免疫系的终身教授，期间Flavell教授是他的系主任。源于这一特殊关系，Richard Flavell教授决定在上海交通大学医学院担任即将成立的上交大-耶鲁免疫代谢中心主任，并且在苏冰教授和李华兵研究员的协助下在上海交通大学医学院建立实验室，直接在中国指导博士生和博士后，为推动上海市免疫学研究所和中国的免疫学研究尽力作出贡献。
原文链接：
http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature23450.html
专家点评：
李斌丨上海市免疫所余㵑学者，分子免疫学课题组组长，资深研究员，国家“杰青”
Comments：耶鲁大学Flavell实验室李华兵博士、朱书博士与暨南大学尹芝南实验室博士生童吉宇等密切合作，通过研究RNA甲基化修饰酶类复合体 METTL3/METTL14家族蛋白的体内生理功能，发现T细胞特异性缺失RNA腺苷甲基转移酶(m6A writer)的小鼠，体内T细胞分化受阻，免疫稳态被打破。其机制涉及到RNA腺苷甲基转移酶特异性调控“信号依赖性早期反应基因”如SOCS家族蛋白编码基因SOCS1，SOCS3和Cish转录体mRNA的3'UTR的m6A修饰及其mRNA的降解周期被打破,影响到初始T细胞分化发育至关重要的IL-7/STAT5信号通路的激活。该研究发现了m6A mRNA 甲基化的体内生理功能，对研究不同类型mRNA 甲基化的体内调控机制及其在不同组织或发育不同阶段的体内生理功能具有开创性意义。
参考文献：
1 Jia, G. F. et al. N6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature chemical biology 7, 885-887, doi:10.1038/Nchembio.687 (2011).
2 Cao, G., Li, H. B., Yin, Z. & Flavell, R. A. Recent advances in dynamic m6A RNA modification. Open Biol 6, 160003, doi:10.1098/rsob.160003 (2016).
3 Batista, P. J. et al. m(6)A RNA Modification Controls Cell Fate Transition in Mammalian Embryonic Stem Cells. Cell stem cell 15, 707-719, doi:10.1016/j.stem.2014.09.019 (2014).
4 Geula, S. et al. Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation. Science 347, 1002-1006, doi:10.1126/science.1261417 (2015).
5 Zhao, B. S. et al. m6A-dependent maternal mRNA clearance facilitates zebrafish maternal-to-zygotic transition. Nature 542, 475-478, doi:10.1038/nature21355 (2017).
6 Lence, T. et al. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature 540, 242-247, doi:10.1038/nature20568 (2016).
7 Haussmann, I. U. et al. m6A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature 540, 301-304, doi:10.1038/nature20577 (2016).
8 Takada, K. & Jameson, S. C. Naive T cell homeostasis: from awareness of space to a sense of place. Nature reviews. Immunology 9, 823-832, doi:10.1038/nri2657 (2009).
9 Rabani, M. et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotech 29, 436-442, doi:10.1038/nbt.1861 (2011).
通讯作者简介：
耶鲁大学免疫学研究处于国际上顶尖水平，引领免疫生物学和免疫医学转化领域最前沿的研究。Richard A. Flavell教授领导的团队代表了耶鲁大学最顶尖的免疫学研究力量。Richard A. Flavell教授1970年毕业于英国赫尔大学生物化学专业，获博士学位。1970-1973年分别于荷兰阿姆斯特丹大学和瑞士苏黎世大学开展博士后研究工作。1974-1979年任阿姆斯特丹大学助理教授。1979-1982年担任英国国家医学研究所基因结构与表达实验室负责人。1982-1988年受聘于美国Biogen公司出任总裁。1988年起就职于美国耶鲁大学医学院，是耶鲁大学医学院免疫学系的创始人，担任免疫学、生物学教授和免疫系主任，并担任系主任长达28年（1988-2016年）；1988年获聘为美国霍华德休斯医学研究所（HHMI）研究员；2002年被耶鲁大学授予Sterling讲席教授头衔（耶鲁大学教授最高荣誉头衔）。Flavell教授获得荣誉众多，1984年成为英国皇家学会和英国皇家科学研究所成员，2002年入选美国国家科学院院士，2006年入选美国国家医学研究院院士。Flavell教授发表各类科研论文迄今共计1090篇，因其在免疫及分子生物学领域内取得的突出贡献而获得国际上许多顶级奖项，担任第一届国际细胞因子及干扰素协会主席（2014-2015），担任多家国际一流学术期刊编辑，包括Immunity杂志副主编 (1994年至今)；Journal of Experimental Medicine杂志编委(2006年至今)；Journal of Clinical Investigation杂志顾问编辑(2010年至今)等。他同时兼任武汉大学，南开大学，苏州大学以及美国的Scripps研究所荣誉教授。
Richard A. Flavell教授是世界上最知名的以及高被引的免疫学家之一（H指数高达219，文章引用数至今达179833），科研工作建树颇丰并继续活跃在科学界，在分子生物学领域和免疫学领域作出了很多原创性重大贡献。他是基因内含子的共同发现者之一，首次证明了DNA甲基化会抑制基因表达。在博士后期间首次发展并使用了反向遗传学研究方法，并在此后的科研生涯中一直积极使用该方法进行生物体内功能实验。其实验室致力于研究免疫应答的分子和细胞学机理，为T细胞由前体细胞分化为各类亚群细胞的分子机制做出了主要贡献；首次发现“接吻染色体”调节基因表达。同时，其实验室还揭示了通过免疫调控从而抑制自身免疫反应和对病原体过激反应的机制；发现了数个受体家族在固有免疫反应中的作用，包括Toll样受体(TLR)和胞内Nod样受体(NLRs)；阐明了Nod2受体及Nalp蛋白在炎症性肠病中的功能。Flavell教授近年来的研究建立了炎性小体、微生物群落和部分慢性疾病之间的关系，证明微生物群落失调将导致炎症性肠病和各类代谢综合征，例如肥胖、脂肪肝、2型糖尿病等。最后Flavell教授也阐明了TGF-b在免疫反应调控中的作用， 为自身免疫疾病和肿瘤免疫逃逸的进一步研究和治疗奠定了坚实基础。
人才培养方面他培养了一大批活跃在当今国际免疫学界知名的免疫学家，其中来自中国的免疫学家代表有清华大学医学院院长董晨教授，美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的李明教授，美国圣犹达儿童研究医院的迟洪波教授，美国北卡罗来纳大学医学院万谊松副教授，美国匹兹堡大学的Binfeng Lu副教授等。Flavell教授在过去的数年间已经和中国的科学家有非常广泛的合作，例如和尹芝南教授在暨南大学的合作。为了继续扩大培养来自中国的人才，Flavell教授即将在上海交通大学医学院与“千人计划专家” 苏冰教授共同组建上交大-耶鲁免疫代谢中心，直接在中国培养博士生和博士后，为中国的免疫学研究贡献力量。
实验室网页： https://medicine.yale.edu/lab/flavell/
李华兵博士于南开大学本科(1999-2002)和硕士(2002-2005)毕业后，先后在国外知名顶尖实验室接受严格的系统科学训练， 完成博士学位研究（2005-2011, 博士生导师：Vincenzo Pirrotta, Rutgers University，国际知名表观遗传学家）与博士后研究训练（2012-2017， 博士后导师：Richard Flavell, Yale University，国际著名免疫学家/美国科学院院士）。在表观遗传学和T 细胞生物学领域，李华兵研究员作为第一作者，共同第一作者和共同通讯作者已在Nature, Science 等国际一流期刊发表研究论文10 余篇。李华兵博士于2017年8月正式全职在上海交通大学医学院免疫学研究所任职表观遗传免疫学课题组组长（研究员, Principal Investigator)。李华兵研究员独立的课题组已经得到上海交通大学医学院以及上海市第一人民医院的有力支持。同时，李华兵研究员将和耶鲁大学Richard Flavell院士以及“千人计划”专家苏冰教授共建实验室／上交大-耶鲁免疫代谢中心。
实验室网页：
http://sii.shsmu.edu.cn/DetailMemberInfo.php?pid=6&cid=22&num=22&id=65
尹芝南教授， 暨南大学生物医学转化研究院院长,国家”杰出青年基金”获得者，教育部“长江学者”特聘教授,科技部重大科学研究计划 (973) 首席科学家， 国家人力资源和社会保障部“高层次海外留学归国创业人才”和新“百千万”人才工程“有突出贡献中青年专家”。2013年7月起作为广东省第四批引进“创新创业团队”带头人被引进到暨南大学。主要研究方向为γδ T细胞的分化发育及其在肿瘤免疫、肝炎和肠道菌群调控中的作用，共发表文章106篇，其中以通讯或共同通讯作者发表文章57篇。尹教授与Flavell 教授合作多年，以共同作者联合发表论文十多篇。该工作受到了国家自然科学基金委重大国际合作项目的支持。
实验室网页： http://biotransmed.jnu.edu.cn
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