复旦温文玉组揭示蛋白相变调控细胞命运决定因子定位的分子机制

细胞极性是大部分细胞都具有的基本性质，影响到细胞生理活动的各个方面，包括细胞生长、分裂、分化及运动等。细胞极性的破坏会改变细胞的信号传导过程以及组织结构，并促进肿瘤的形成及转移。尽管细胞的形态与功能各不相同，细胞极性建立的共性，是一些极性蛋白复合物被特异地招募到指定膜区域，并发生显著的局部聚集【1-4】。这些极性蛋白质（如PAR-3/PAR-6/aPKC，Frizzled/Dishevelled/Diego复合物等）通过相互作用自发形成高度浓缩的块状或点状聚集体结构，附着于细胞质膜内表面，并可响应细胞信号发生去组装。然而这些蛋白复合物极性聚集进而建立细胞极性的分子机制尚不清楚。

2月21日，复旦大学生物医学研究院/华山医院神经外科温文玉课题组与新加坡国立大学淡马锡生命科学研究院Yu Cai（蔡毓）课题组合作在Nature Communications杂志在线发表了题为“Basal condensation of Numb and Pon complex via phase transition during Drosophila neuroblast asymmetric division”的科研论文，该论文报道了果蝇神经干细胞不对称分裂时，细胞命运决定因子Numb和连接蛋白Pon之间的特异性多位点结合导致Numb/Pon复合体发生液-液相变（liquid-liquid phase transition, LLPT）分离。该相变反应介导了Numb在神经干细胞底端皮层的极性富集进而调控了神经干细胞的分化。

在果蝇神经干细胞（neuroblast，NB）发生不对称分裂时，特定的蛋白质极性分布在细胞两端：保守的PAR蛋白复合物(PAR-3/PAR-6/aPKC)/CDC42，Inscuteable，Pins和Gαi定位在顶端皮层（apical cortex）；命运决定因子Numb，Prospero，Brat和Staufen，以及衔接蛋白Pon和Miranda定位在底端皮层（basal cortex）。NB不对称分裂时，以Pins为核心的纺锤体转向力系统调控纺锤体沿着细胞顶-底极性轴定向，使细胞命运决定因子不对称分离到底部子细胞中，并促使其分化产生神经细胞。

一个有趣的现象是，顶端和底端皮层定位的蛋白复合物仅仅在细胞两极很小的区域形成新月状聚集体，而不是均匀分布在整个顶部或底部半皮层。新月聚集体仅发生在分裂期，分裂结束这些蛋白又均匀分布至整个质膜或胞质中。更有意思的是，新月聚集体中高度浓缩的蛋白并不是稳定地锚定在皮层上，而是与细胞质中的蛋白存在着快速的动态交换。这些蛋白复合物的动态分布特性对于细胞不对称分裂可能是至关重要的，使之能够快速应答细胞周期信号。但一些基本问题仍然有待回答，比如，这些高度聚集的极性蛋白复合体如何在特定的膜区域自发形成？新月体与胞质中这些极性蛋白复合体的高度浓度差是如何维持的？ 

这项研究发现，在NB不对称分裂时，命运决定因子Numb PTB结构域上两个独特的蛋白表面以一种非典型的模式特异性识别Pon中的重复模序，这种多位点结合模式诱导该复合物发生液-液相变分离，在体外和细胞中能够自发组装形成致密的无膜液相结构。而这种相变液滴可以被Numb PTB的竞争多肽破坏并去组装。在这些分相的液滴中，Numb/Pon复合物是高度浓缩的，但同时又与周围溶液中低浓度的Numb/Pon蛋白存在快速的动态交换，这一现象与在体数据高度吻合。研究人员进一步证明Pon作用于Numb-Notch信号通路上游以促进NB的分化，而对Numb/Pon复合物相变过程的干扰将破坏果蝇神经干细胞不对称分裂时Numb的底部定位过程，并影响其不对称分离和对Notch信号通路的抑制，最终形成肿瘤样NB增生（下图）。

近年的研究表明生物大分子（蛋白质、核酸）的相变在生命活动中发挥着至关重要的作用。无膜细胞器如核仁、有丝分裂纺锤体、中心体、各种细胞体和RNA颗粒（如应激颗粒），以及一些质膜下的信号传导复合体（如神经突触后密集区PSD和T细胞信号传导通路等）的形成都是由特定组分的相变过程驱动的，多种人类疾病如神经退行性疾病也与生物大分子的相变密切相关【5-7】。鉴于极性蛋白复合物（如PAR-3/PAR-6/aPKC，Frizzled/Dishevelled/Diego复合物等）在特定膜区域的聚集与Numb/Pon新月聚集体形成的情况非常类似，相变有可能广泛地应用于细胞极化过程，即这种蛋白相互作用引起的相变可能是调控极性蛋白复合物在特定膜区域异位浓缩的一个普遍机制。这将有助于构建高级、复杂的蛋白质作用网络，进而高效、特异地调控信号传导通路。

据悉，复旦大学博士生山泽林和涂雨婷，以及新加坡国立大学Ying Yang为论文共同第一作者，温文玉研究员和Yu Cai教授为论文的共同通讯作者。该研究还得到了香港科技大学张明杰教授，南开大学龙加福教授等的大力支持。

温文玉课题组长期致力于研究神经早期发育及神经信号转导过程中重要调控蛋白质的结构与功能，以及其与神经系统疾病（如脑肿瘤）的关联性。近期比较系统地研究了神经干细胞不对称分裂过程的分子机制（Mol Cell, 2010；Mol Cell, 2011；EMBO J, 2011；J Mol Biol, 2013；Nat Commun, 2015；Structure, 2016；EMBO Rep, 2017；J Biol Chem, 2018；Nat Commun, 2018）：提供了纺锤体转向力产生系统的组装机制，发现Insc与Mud竞争结合Pins，从而提出调控细胞极性建立的PAR/Insc/Pins通路与调控纺锤体转向的Gαi/Pins/Mud通路为相对独立并顺序发生的过程，更新了我们对干细胞不对称分裂过程的认识；发现驱动纺锤体转向的DLG/Pins复合体的组装受激酶aPKC的磷酸化调控，进而发现GK结构域演化为一个全新的磷酸化蛋白结合模块，为揭示神经突触后密集层中众多MAGUK家族蛋白GK结构域的生物学功能提供了有力线索，也为突触的可塑性提供了新的机理；阐述了介导蛋白极性分布的膜融合SNARE蛋白Ykt6胞内定位及活性调控的分子机理，发现Ykt6的棕榈酰化修饰除了使其锚定在质膜上，还能调控其SNARE活性；揭示了衔接蛋白Miranda识别并调控细胞命运决定因子Staufen、Brat等极性分布的分子机制；揭示了在细胞周期激酶Cdk1、Polo调控下，命运决定因子Numb随其衔接蛋白Pon在底部皮层异位聚集的分子机制；阐明了神经发育过程中，调控神经元迁移的E3泛素连接酶Itch自抑制及激活的分子机理。

参考文献：

1. Mellman, I. & Nelson, W.J. Coordinated protein sorting, targeting and distribution in polarized cells. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 833-45 (2008).

2. Rodriguez-Boulan, E. & Macara, I.G. Organization and execution of the epithelial polarity programme. Nat Rev Mol Cell Biol 15, 225-42 (2014).

3. Knoblich, J.A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 849-60 (2010).

4. Yang, Y. & Mlodzik, M. Wnt-Frizzled/planar cell polarity signaling: cellular orientation by facing the wind (Wnt). Annu Rev Cell Dev Biol 31, 623-46 (2015).

5. Hyman, A.A., Weber, C.A. & Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol 30, 39-58 (2014).

6. Bergeron-Sandoval, L.P., Safaee, N. & Michnick, S.W. Mechanisms and Consequences of Macromolecular Phase Separation. Cell 165, 1067-79 (2016).

7. Shin, Y. & Brangwynne, C.P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science 357(2017).

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