Nat Biotech | 陈良怡、谭山合作团队发明超灵敏海森结构光超高分辨率显微镜——徐平勇点评

责编 | 迦溆、狄德罗

北京大学陈良怡团队联合华中科技大学谭山团队发明了一种超灵敏结构光超高分辨率显微镜——海森结构光显微镜 （Hessian SIM)，实现了活细胞超快长时程超高分辨率成像，能辨清囊泡融合孔道和线粒体内嵴动态。此项成果近日以长文形式在线发表于Nature Biotechnology ，论文题目为Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy 。BioArt邀请到了从事超高分辨率荧光显微成像新技术新方法研究的徐平勇研究员做精彩点评，以飨读者！

眼

见为实。显微镜是生物医学研究领域最常用的工具，但因为其分辨率受到衍射极限的限制，很多信息都隐藏在看不清楚的信号中。从英国人罗伯特胡克发明显微镜的那一天开始，看到更清楚的细胞器和蛋白等结构，并在活细胞中长时间追踪它们的动态变化，一直是所有生物医学研究者的梦想。

21世纪的第一个十年见证了两百年的梦想逐渐照进现实。随着不同原理的超级显微镜的发明，打破衍射极限、实现超高分辨率荧光成像成为可能。相关工作获得了2014年的诺贝尔化学奖，国际上各大显微镜公司也推出了各种各样的超高分辨率显微镜。但是，目前的超级显微镜都需要超强的激发光，相当于细胞被一万个太阳到一千万个太阳所照亮（10⁴~10⁷ W/cm²），才能够得到超高分辨率的荧光图像。同时，强光产生的光漂白效应和对细胞的光毒性效应又极大限制了此类显微镜的应用。因此，生物学家仍然渴望降低超高分辨率显微镜所需要的光照度，真正实现长时间的观察活细胞内高速变化的动态过程。

针对这个挑战，陈良怡与谭山两个课题组联手改造和重建了现有的结构光超高分辨率显微镜（SIM）。硬件上，通过尽量提高显微镜收集光子的能力（如用高数值孔径物镜）和减少采样每张图像的时间（如自主设计偏振旋转玻片阵列以及高精度的时序控制程序），实现每秒得到188幅超高分辨率图像。算法上，团队也研发了全新的反卷积算法，借鉴人眼区分信号和噪声的机制，首次提出将生物样本在多维时空上连续、而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵，指导超高分辨率荧光图像的重建，从而得到超灵敏海森结构光显微镜（Hessian SIM）。依靠这些硬件和算法的革新，Hessian SIM显微镜实现了在传统SIM显微镜光照度1/10的情况下，得到了和十倍照明的传统SIM显微镜同样分辨率和保真度的超高分辨率图像。

海森结构光显微镜显微镜下观察到COS-7细胞中的内质网和线粒体相互作用的动态过程，蓝色的线粒体用MitoTracker Green标记，可以清楚辨识内嵴结构；品红色的是用SEC61-mCherry标记内质网结构。

在每秒钟得到188张超高分辨率图像时，Hessian SIM的空间分辨率可以达到85纳米，能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构，而所需要的光照度只有8 W/cm²（相当于80个太阳左右），小于常用的、非超分辨率的点扫描共聚焦显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性，我们实现100 Hz超高分辨率成像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像，或者是在1 Hz超高分辨率成像下连续1小时超高分辨率成像基本无光漂白。

与同样可以用于活细胞成像的受激辐射损耗超高分辨率显微镜（STED）相比，Hessian SIM可以提供更高的时间分辨率。例如，在观察细胞内囊泡与细胞质膜融合释放神经递质和激素过程中，我们的Hessian SIM与STED（ 巫凌刚实验室今年3月发表于Cell的研究使用的即为STED）都可以观察到囊泡融合形成的孔道；但是，只有用Hessian SIM，才能观察到囊泡融合时四个不同中间态，包括囊泡打开3纳米小孔、囊泡塌陷、融合孔维持和最后的囊泡塌陷过程，真正可视化膜孔道形成的全过程（图2）。

图2. 囊泡融合孔道形成全过程。A: 实际动态过程；B：30年前的电镜观察到的结果；C：随时间变化的荧光动态变化；D：囊泡融合的四个中间态（融合小孔打开→囊泡塌陷→融合孔道维持→囊泡完全融合）。

Hessian SIM 的低光毒性也帮助它观察在生理条件下才能工作的细胞结构。例如，线粒体作为细胞内的“能量制造工厂”，其内嵴结构可以在电镜下观察到，但从未被之前的超高分辨率显微镜所清楚观察到，主要是因为超高分辨率显微成像观察线粒体的过程产生的光毒性就已经破坏了线粒体的内嵴结构。应用超灵敏Hessian SIM，我们首次在活细胞中连续观察800张并清楚辨识线粒体内嵴结构和动态，从而首次解析两个线粒体融合时，或者是单个线粒体分裂时内嵴的活动，以及观察到单个静息线粒体两条内嵴融合成为一条的重组装过程（图3）。

图3. Hessian SIM显微镜下观察到线粒体内嵴结构动态。A. 连续观察800张COS-7活细胞内MitoTracker标记的线粒体内嵴。B, C. 两个线粒体融合时：B或是一个线粒体分裂成两个时; C.内嵴的变化。D. 静息线粒体内也可以观察到内嵴的重组。

综上所述，超灵敏Hessian SIM显微镜适用于各种不同细胞、不同探针的荧光成像，适用于所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景。进一步，它在实现超高分辨率显微成像的同时，首次实现了长时间活细胞超高速成像，是目前成像时间最长、时间分辨率最高的超高分辨率显微镜。可以说，所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜，因而具有广泛的应用前景。

 该论文的第一作者为北京大学黄小帅、华中科技大学范骏超和北京大学李柳菊，通讯作者为北京大学陈良怡、华中科技大学谭山。陈良怡、黄小帅等主创成员参与了早先发表于Nature Methods的高分辨率微型化双光子显微镜的研制，荣获2017年中国十大科学进展等荣誉。未来，他们将进一步实现微型化海森结构光的显微在体成像。

专家点评

徐平勇（中科院生物物理所研究员）

细胞内亚细胞器是动态组装和快速运动的，不同的亚细胞器有不同的运动速度。有些与亚细胞器相关的生理过程非常快，只有几十毫秒，例如囊泡的分泌、线粒体的动态组装、钙库的释放等过程。现有的超高分辨显微成像方法能够解析固定的细胞中蛋白质在亚细胞器中纳米尺度的相对精确定位，但是对于活细胞中快速运动的亚细胞器的超高分辨成像具有很大的挑战。主要原因是现有成像技术的时间分辨率低，不足以解析快速运动的亚细胞器或者蛋白质的定位。提高现有超高分辨显微成像的时间分辨率至少能产生两个方面的效果：一是能减少由于快速运动产生的假象，例如快速运动的点成像速度慢时可以变为一条线。二是能提高图像重构的准确度，例如2D-SIM成像需要9帧原始宽敞图像来重构一张超高分辨成像图，重构时假定在采样9帧原始图像时亚细胞器结构是不变的。如果采样时时间分辨率低，亚细胞器在这9帧中的结构就是变化的，最终重构出来的结果就不准。这两种效果最终表现为提高了成像的空间分辨率。提高时间分辨率后能观察到活细胞中不一样的动态结构，例如当STED照射很小的区域提高时间分辨率到每秒5幅后就可以观察到囊泡融合形成的孔道（巫凌钢实验室2018Cell文章）。

2D-SIM由于重构时需要的原始图像的帧数少，比基于单分子定位的PALM/STORM成像技术以及基于点扫描的STED成像技术具有更高的时间分辨率，适合大面积活细胞超高分辨显微成像。然而受限于液晶相位可变延迟器（LCVR）的调制速度，目前TIRFM-SIM成像的最高时间分辨率约为0.25秒，不足以观察线粒体嵴等快速运动的结构。北京大学陈良怡和华中科技大学谭山等合作，发展了基于偏振旋转玻片阵列的Hessian结构光照明系统，极大地提高了成像的时间分辨率（每秒188张超高分辨图像）。时间分辨率的提高意味着每帧图像的曝光时间缩短，短曝光时间会使得采集到的荧光信号大大降低，弱信号和相对较低的信噪比在SIM重构时会产生很多小圆圈的假象结构。

该工作的另一的创新是发展了在极低曝光时间下弱信号的去噪算法，用于重构超高分辨图像，极大地减少了重构的假象结构。Hessian SIM成像技术通过结合硬件上的加速采样和弱信号的降噪算法，首次在活细胞中观察到了线粒体嵴长时程动态运动，对于线粒体功能研究提供了重要的工具。该工作告诉我们，进一步提高超高分辨成像的时间分辨率可以观察到以期观察不到的亚结构和动态过程。该方法具有广泛的应用前景，首先，弱信号的去噪算法可以用到其它的成像方法中用于提高弱信号的信噪比，有望提高其它成像方法的准确度和分辨率。另外，由于SIM比PALM/STORM和STED更容易实现双色超高分辨成像，该方法有望在活细胞中对同一亚细胞器中的不同蛋白进行同时标记和成像，动态监测亚细胞器的组装和解组装过程。Hessian SIM成像方法特别适合在COS7等超薄细胞中观察内质网和线粒体等亚细胞器。

目前该方法的Z轴分辨率不高，实际成像应用中受到样品厚度的影响。希望陈良怡老师在今后的Hessian SIM基础上进一步发展提高Z轴分辨率的成像方法，拓展更多的生物学应用。

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