三个小组的激烈竞争丨细胞质RNAi跨代遗传机制取得突破性进展

编者按：某个重要的学术成果出现往往伴随着多个课题组激烈的竞争，而竞争的背后较为常见的特征是多个课题组的成果集中在某个时间点前后发表，除了同行评议的学术刊物外，预印本bioRxiv经常也加入到一系列竞争中来。今天BioArt报道的这个故事就涉及多位大咖以及大咖实验室出来回中国独立建实验室的年轻学者。

责编丨子 信/迦 溆

1892年，德国进化生物学家 August Weismann在他出版的《The Germ Plasm: a theory of inheritance》书中，首次提出种质学说（Germ Plasm）。该理论指出，多细胞生物的体细胞与生殖细胞是分离的。体细胞由于环境影响所发生的适应性变化不能通过生殖细胞遗传到下一代。生殖细胞只保留将DNA遗传信息传递到下一代的能力。而在过去的数十年里，越来越多的研究表明，生殖细胞的遗传信息不仅仅是DNA序列，同时也包括表观遗传修饰以及一些非DNA的生物大分子如tRNA和small RNAs等。环境影响可以引起跨代遗传（transgenerational）的表观修饰的变化，同时也可以引起noncoding RNAs表达与修饰等变化。

RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是一种广泛存在于动物、植物以及真菌中的一种保守机制。1998年Craig Mello和Andy Fire等人在Nature期刊中发表题为“Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans“ 的研究，该文利用模式生物秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)首次证实双链RNA分子可诱导同源目标mRNA 降解，并导致特定基因表达沉默，并且这种沉默可以遗传到子代中【1】。随后，越来越多的研究表明RNAi的调节机制广泛存在于许多生命体中。RNAi真正大放异彩是在2002年——siRNA当选为Science 2002年度10大重要突破之首。从2001-2006年，RNAi的研究和应用达到了前所未有的新高度，并成为基因功能研究和基因治疗领域的最热门技术之一，而且于2006年被授予诺贝尔生理学奖。

此后的研究发现，在线虫中，外源性dsRNA产生的small RNAs和内源性piRNA产生的small RNAs都可以在子代中持续表达，并可以持续多代（>=3）地沉默基因表达。此现象被称为RNA干扰的跨代遗传现象（transgenerational inheritance of RNAi）。随着获得性表观跨代遗传的研究热潮，线虫中RNAi的跨代遗传现象得到了广泛关注，其机制研究也有了突飞猛进的势头。RNAi遗传可分为沉默信号的建立、传递和维持三个过程。在揭示RNAi跨代遗传机制中，主要涉及细胞核干扰(nuclear RNAi)和细胞质干扰(cytoplasmic RNAi)两种机制。

过去研究的相对比较清楚的是细胞核干扰方式，其中一个重要的时间结点是在2012年。Scott Kennedy课题组（Scott Kennedy是拉斯克奖得主Gary Ruvkun的博后，Gary Ruvkun早期在microRNA lin-4的作用机制和发现第二个microRNA let-7上做出了杰出的贡献。Gary Ruvkun的博后中还有最近刚成为HHMI研究员的王萌以及去年成为HHMI国际青年学者的刘颖）通过对线虫进行基因筛选，筛到了hrde-1 (heritable RNAi defective 1)基因。Hrde-1基因编码Argo (Argonaute)蛋白，在生殖细胞中该蛋白与小的干扰RNA相结合，并招募下游的NRDE因子(nuclear RNAi defective)-1/2/4，抑制Pol II的转录，引起RNAi靶标的基因组位置产生H3K9和HKK27的三甲基化修饰，造成基因沉默并促进基因沉默的遗传【2】。几乎同一时间，剑桥大学的Eric Miska教授和诺贝尔奖得主Craig Mello教授也发现了hrde-1这个基因对介导线虫RNAi的跨代遗传有着重要作用【3-4】。随后几年的研究使得细胞核干扰机制更加明朗。

那么细胞质RNAi是否以及如何参与RNAi遗传呢？

2017年Scott Kennedy在一篇genetic screening 的工作中，发现一些somatic protein也参与了RNAi的跨代遗传，但其作用机理尚不明确【5】。近期三篇工作利用线虫作为模式生物筛选了一批新的介导细胞质RNAi跨代遗传的基因并对其机制进行了探究。

5月16日，哈佛医学院Scott Kennedy课题组在Nature以长文（Article）形式发表题为“Spatiotemporal regulation of liquid-like condensates in epigenetic inheritance“的研究，该研究发现ZNFX-1解旋酶与WAGO-4 (nuclear-worm-specific Argonaute-4)蛋白在RNAi的遗传中具有重要作用。

该文首先通过筛选发现ZNFX-1是TEI (transgenerational epigenetic inheritance)中不可或缺的，随后，发现WAGO-4可与ZNFX-1相互作用共同介导了RNAi的TEI。在线虫中有一种通常被称为P颗粒(P granules)的物质（线虫性腺中细胞核周围与RNA作用的蛋白质组分，能够发生“相变”，处于动态变化中，也是当前相变研究的一个热点）。P颗粒通过一种不对称的分裂方式，将其只分配到生殖细胞中(P0-P4)，随后P4最终形成两个原生殖细胞Z2和Z3。该文中研究发现在发育早期P1-P3中，ZNFX-1与WAGO-4定位于P颗粒，但当P4分裂成Z2和Z3时，ZNFX-1与WAGO-4的定位发生了变化，接近P颗粒但又与其定位不同。随后研究人员还发现，ZNFX-1和WAGO-4定位在一个新的液滴状细胞器中，文中称为Z granules。有趣的是，这个Z granules在P granules和Mutator foci之间起着桥梁(bridge)的作用，而且它们可以独立存在。研究人员将P granules、 Z granules 和Mutator foci组装成的三浓缩聚集物成为PZMs，并且发现PZM的组装对RNA介导的TEI具有重要作用。研究表明Z granules的形成以及功能的发挥是受到时间上和空间上调控的，因此推测这样的时空调控可以更好的帮助理解细胞内精细的RNA 参与过程。

次日（5月17日），诺贝尔奖得主Craig Mello课题组在Molecular Cell 发表题为”ZNFX-1 Functions within Perinuclear Nuage to Balance Epigenetic Signals “的研究，同样通过基因筛选，发现ZNFX-1这个解旋酶在维持pi-RNA介导的表观遗传沉默过程中起着重要作用。同时研究人员通过 Co-IP 技术发现，ZNFX-1可以和至少三个不同的Argo蛋白和RdRP(RNA-dependent RNA polymerase)蛋白直接结合，并参与到piRNA位点附近小RNA的扩增过程。惊奇的是，ZNFX-1不仅是RNAi沉默过程所必须的，并且通过阻止表观遗传信号移向靶mRNAs的5‘端来维持表观遗传的平衡。该研究提示了ZNFX-1可能在表观遗传的调控过程中具有时空性，同时也提出了“Z granules”的概念。

5月22日，中科大的光寿红教授课题组在Cell Reports上发表题为” A Cytoplasmic Argonaute Protein Promotes the Inheritance of RNAi “的研究，主要探究了Argonaute蛋白——WAGO-4在RNAi跨代遗传中的作用。首先证明了WAGO-4参与了双链RNA介导的基因沉默，并进一步证实wago-4基因是RNAi遗传中必不可少的。WAGO-4的定位发现，在发育早期，WAGO-4表达在P1颗粒和EMS细胞中，但在晚期胚胎中，WAGO-4仅表达在Z2/Z3细胞中。随后，比较了WAGO-4和HRDE-1介导的RNAi遗传机制，发现WAGO-4可能参与到从亲本向子代传递小RNA的过程，并且这一过程早于HRED-1在子代中重新建立沉默状态。进一步研究表明WAGO-4结合22G RNA，并靶标到基因组序列上。CDE-1是一个生殖细胞特异表达的核苷转移酶, 尿嘧啶转移酶CDE-1可能通过对于WAGO-4结合的22G RNA进行尿嘧啶化修饰，来促进RNAi的遗传过程。该文的第一作者是光寿红研究组的徐飞博士和冯雪竹副教授，他们共同完成了本文的全部工作。

历史总是惊人的相识，2012年三个课题组几乎同时发现了细胞核RNAi的遗传机制。而目前的这三篇文章，又在相似的时间节点，分别从不同的角度揭示了细胞质RNAi的遗传机制。从三个独立课题组的工作来看，Scott Kennedy组同时做了两个关键蛋白WAGO-4与ZNFX-1，而且更为重要的是命名了Z-granules并发现和之前的P-granules以及Mutator foci形成多液滴细胞器PZMs。Craig Mello组则是研究了ZNFX-1可能在表观遗传的调控过程中具有时空性，同时也提出了“Z granules”的概念。而光寿红组主要集中在了WAGO-4的鉴定和机制研究上，相对而言缺少了新的granules的concept，当前由于“相变”的研究热潮，提出新的“液滴”状态或许杂志社更加感兴趣。

值得一提的是，Kennedy组的工作今年一月份已经发表在了预印本上，而光寿红组稍晚些时候也在预印本上把相关工作发了出来。

总的来说，三个研究相互补充、相互支持，并为后续的研究提供了方向。为读者们提供了一场丰盛的学术盛宴，也展示了学术研究竞争的激烈性，望大家共勉。

彩蛋：光寿红教授（“青年千人”）的博士后导师就是Scott Kennedy教授。Kennedy在威斯康星大学麦迪逊刚开始做助理教授的时候，光寿红教授就加入了Kennedy的实验室。他们一起发现了多细胞真核生物中存在细胞核RNA干扰现象，并因此发现了Nrde通路【6】和解析了相应的转录调控机制【7】。光寿红教授于2010年底回到中国科学技术大学开始自己的实验室，继续从事细胞核RNA干扰和小RNA的相关研究。Kennedy则在2015年转到哈佛大学任Philip and Aya Leder冠名教授（Philip Leder是美国科学院院士，Lasker奖和美国国家科学奖的获得者）。

参考文献

1.    Fire, A., et al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998. 391(6669): p. 806-11.

2.    Buckley, B.A., et al., A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality. Nature, 2012. 489(7416): p. 447-51.

3.    Bagijn, M.P., et al., Function, targets, and evolution of Caenorhabditis elegans piRNAs. Science, 2012. 337(6094): p. 574-578.

4.    Shirayama, M., et al., piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline. Cell, 2012. 150(1): p. 65-77.

5.    Spracklin, G., et al., The RNAi Inheritance Machinery of Caenorhabditis elegans. Genetics, 2017. 206(3): p. 1403-1416.

6.    Guang, S., et al., An Argonaute transports siRNAs from the cytoplasm to the nucleus. Science, 2008. 321(5888): p. 537-41.

7.    Guang, S., et al., Small regulatory RNAs inhibit RNA polymerase II during the elongation phase of transcription. Nature, 2010. 465(7301): p. 1097-101.

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