亮点推荐丨叶海峰组实现远红光控制细胞命运

责编丨迦 溆

新型光遗传学工具实现远红光控制细胞命运（图片由叶海峰课题组提供）

随着哺乳动物合成生物学的飞速发展，诱导型基因环路被广泛应用于基因功能的研究、代谢性疾病、神经性疾病以及肿瘤的治疗。目前大多数诱导型基因环路只能诱导外源导入基因的表达而无法直接操纵内源基因组基因的表达。虽然研究者们已经开发出了蓝光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录系统能操纵内源基因组基因的表达【1,2】，但是由于蓝光具有较强的细胞毒性和组织穿透性弱等缺点【3】，极大的限制了其在基因功能的研究和转化医学的应用。

7月2日，华东师范大学生命科学学院、上海市调控重点实验室研究员、“青年千人”叶海峰团队在PNAS杂志上发表了题为Synthetic far-red light-mediated CRISPR-dCas9 device for inducing functional neuronal differentiation的最新研究成果，克服了蓝光调控CRISPR-dCas9的缺点，将CRISPR-dCas9和光遗传学这两大技术相结合，开发出了远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置（FACE），该系统具有诱导倍数高、组织穿透力强、高度时空特异性以及低毒性等优点。证明了FACE系统具有更好的组织穿透力，展现出FACE系统在未来体内临床应用研究中的巨大潜力，为将来临床应用奠定了坚实的基础。从理论上讲，利用该技术只要一束远红光就可以控制干细胞分化成任意一种想要的功能性细胞，比如心脏细胞、神经细胞等。

在这项研究中，研究人员巧妙利用合成生物学、光遗传学、基因编辑、再生医学等多种技术手段，开发了远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置（Far-red light （FRL）-activated CRISPR-dCas9 effector (FACE) device，下图）。

远红光控制的CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置（FACE）。远红光诱导表达的转录激活子FGTA4(MS2-p65-HSF1)与sgRNA/dCas9复合体相结合，在sgRNA/dCas9复合体靶向作用下，诱导下游内源基因的表达。

研究者们利用合成生物学的设计原理，将来自于红细菌中响应远红光的蛋白BphS、链球菌中的转录因子BldD、酿脓链球菌中的dCas9蛋白等经理性设计、组装合成远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录激活装置（FACE，见上图），在远红光照射下，经sgRNA/dCas9的精准定位，能实现操控靶标基因上调表达的目的。

首先，研究者们在细胞水平测试了FACE系统的功能。研究证明FACE在远红光的诱导下，激活内源基因具有很好的光照强度和时间的依赖性、广谱性、可逆性以及高度的时空特异性（下图1）；研究者们还证明了FACE系统可以同时激活多个内源基因，且相互之间没有干扰，具有正交性（下图2），为研究基因组内源基因功能提供了强有力的技术手段。

1、 FACE系统的高度时空特异性。远红光时空调控表达绿色荧光蛋白，可以实现使用远红光在体外培养的单层细胞上任意写字。左图为远红光时空特异性装置示意图，右图为镂空ECNU字样的Photomask和远红光激活细胞表达绿色荧光蛋白结果图。

2、 细胞水平证明该FACE系统可以同时激活多个内源基因，且相互之间没有干扰。

随后，研究者们将FACE装置通过电转导入小鼠后腿肌肉中，经远红光照射诱导后成功上调了小鼠肌肉中的Lmama1和Fst基因，实现表观遗传操控。而同等条件下，蓝光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录系统(CPST2.0)则无法上调相应的基因表达。证明了FACE系统具有更好的组织穿透力，展现出FACE系统在未来体内临床应用研究中的巨大潜力，为将来临床应用奠定了坚实的基础。

最后，研究者们将FACE装置导入诱导性多能干细胞（iPSCs）中，同时导入靶向内源基因的sgRNA, 在远红光照射下能通过激活单个内源神经转录因子NEUROG2将iPSC成功分化为功能性神经细胞（下图）。为精准可控的再生医学研究提供了一种新策略和方法。

在远红光的诱导下，FACE系统将IPSc诱导分化为功能性神经细胞

总的来说，该研究首次在细胞水平和动物体内实现了利用远红光操控基因组内源基因的表达，并在远红光诱导下，成功地将iPSCs诱导分化为功能性神经细胞。这些研究进一步开拓了光遗传学工具箱，为哺乳动物细胞基因组的精密时空遗传调控的基础理论研究和转化应用研究奠定了基础，进一步促进了基于光遗传学的精准治疗和临床转化研究。此外，研究人员利用远红光调控的这一系统，还可以通过精确调控光束实现体内外靶标基因的可逆激活，具有高度时空特异性、强组织穿透力以及无毒副作用等优点。未来，在再生医学领域，比如对于肌肉萎缩的治疗等，也将带来新的希望。

华东师范大学叶海峰课题组设计合成了一个强大的远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录装置FACE系统，有着诱导倍数高、可逆性好以及高度时空特异性等特点，就像图中所示中国古典神话小说中能够进行七十二变、具有强大法力的孙悟空，可以通过吹一口气将猴毛变化出其他事物。为了测试FACE装置的强大功能，他们将人工设计合成的FACE装置导入至诱导型多功能干细胞（iPSCs）中，通过远红光的照射，成功的将iPSCs细胞诱导分化成有功能的神经细胞，从而证明了FACE装置可以远红光诱导下时空精准调控基因组基因的表达，可以广泛应用于基础和转化医学的研究。（图片由叶海峰课题组提供）

据悉，叶海峰研究员为该研究论文的通讯作者，博士研究生邵佳伟（2016级）、副研究员王美艳和博士研究生余贵玲（2017级）为该研究论文的共同第一作者。

从左起分别为：本研究共同第一作者博士研究生邵佳伟、余贵玲、副研究员王美艳以及本研究通讯作者叶海峰研究员。

叶海峰课题组近年来在合成生物学领域连续取得多项重要创新性成果。2017年，该课题组在Science Translational Medicine杂志上以封面论文形式报道了首次通过智能手机实现远程调控治疗糖尿病【4】（【独家专访】华东师大叶海峰组首次通过智能手机实现远程调控治疗糖尿病）；2016年在Nature Biomedical Engineering杂志上报道，利用合成生物学的策略设计构建了一种智能胰岛素传感器，可以高效识别血液中胰岛素水平，精准调控细胞表达脂联素，有效地降低血脂和血糖从而缓减胰岛素抵抗的症状，该技术有望将来在临床上用于胰岛素抵抗综合征的诊疗【5】（华东师大学者在Nature子刊发表治疗胰岛素抵抗智能传感器的重要研究成果）；此外，叶海峰研究院还在另一项关于人造胰岛细胞治疗糖尿病的突破性研究中有重要贡献，相关工作发表在2016年的Science杂志（人造胰岛β细胞研究取得重大突破）。

通讯作者简介：

叶海峰研究员于2007.8-2013.12在瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）从事博士和博士后研究工作。于2014年2月底回到母校华东师范大学受聘为“紫江优秀青年学者”，担任生命科学学院、上海市调控生物学重点实验室研究员、博士生导师。叶海峰研究员主要从事合成生物学与生物医学工程领域的研究。2015年入选中央组织部第十一批“青年千人计划”，2015年获得国家自然科学基金委“优青”资助。叶海峰博士回国工作以来，带领自己的研究团队以通讯作者身份在Science Translational Medicine（封面文章）、Nature Biomedical Engineering、PNAS、Molecular Therapy 等高影响力杂志发表研究成果。主要研究内容包括：人工基因电路和定制细胞的设计与合成、光遗传学、精准可控基因编辑体系、代谢疾病智能诊疗、肿瘤免疫智能诊疗、合成生物学与再生医学、微生物合成生物学与疾病智能诊疗等。

参考文献：

1、Polstein LR, Gersbach CA (2015) A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol 11:198–200.

2、Nihongaki Y, et al. (2017) CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription systems to induce neuronal differentiation. Nat Methods 14:963–966.

3、Müller K, et al. (2013) A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res 41:e77.

4、Shao, J., Xue, S., Yu, G., Yu, Y., Yang, X., Bai, Y., ... & Ye, H. (2017). Smartphone-controlled optogenetically engineered cells enable semiautomatic glucose homeostasis in diabetic mice. Science translational medicine, 9(387), eaal2298.

5、Ye, H., Xie, M., Xue, S., Charpin-El Hamri, G., Yin, J., Zulewski, H., & Fussenegger, M. (2017). Self-adjusting synthetic gene circuit for correcting insulin resistance. Nature biomedical engineering, 1(1), 0005.

BioArt，一心关注生命科学，只为分享更多有种、有趣、有料的信息。关注请长按上方二维码。投稿、合作、转载授权事宜请联系微信ID：fullbellies 或邮箱：[e-mail]