Cell亮点丨mTORC1通过调节拥挤来控制相分离和细胞质的生物物理性质

撰文丨小白薯 博士

责编丨迦溆

大分子拥挤（Macromolecular crowding）对反应速率和细胞内部的物理特性有着深远的影响，但是调控拥挤的机制知之甚少。前不久，Cell在线发表了题为mTORC1 Controls Phase Separation and the Biophysical Properties of the Cytoplasm by Tuning Crowding的研究长文，揭示了mTORC1在调节控制细胞内环境分子拥挤和相变中的重要作用【1】。

细胞内环境非常复杂，拥有成百上千的生物大分子。然而，细胞是如何在如此复杂的环境中保持自身稳定、准确、高效的运转，其中的机制尚不清楚。对于生物系统而言，分子拥挤至关重要【2】。实验表明，如果将非洲爪蟾卵提取物稀释超过百分之几，基本的生物学过程如有丝分裂和DNA复制将不再进行【3】，可见分子拥挤具有显著的浓度效应。相分离是研究生物大分子拥挤调控的典型例子。蛋白质可以自身聚结成浓缩液相，不与溶剂相互作用而发生相变过程【4】。相变在转录、翻译、染色质形成，细胞分裂、疾病发生等过程中起着重要作用。然而，控制细胞内拥挤的生理机制以及拥挤对体内相分离的影响仍不明确。

前人研究大分子拥挤和相变等特征的一种方法是观察示踪粒子在细胞内的运动情况。这种方法被称为被动微流变学（passive microrheology），从这些示踪粒子的运动特征可推断周围物质的粘度，弹性，结构和动力学。例如，此前有研究小组利用显微注射，将非生物纳米颗粒作为示踪粒子研究在细胞中的运动【5】。但该技术通常会对细胞造成干扰，注射会稀释细胞质，破坏细胞膜和皮层，并且对有细胞壁的生物难度非常大，例如酵母。另一种方法是追踪内源性特征结构分子的运动，例如用荧光蛋白标记于环状RNA分子特异结合的蛋白，观察在细胞内的运动和变化情况【6】。然而，如果内源性分子的运动受到扰动，则很难知道这些运动变化是由细胞本身特性的影响引起的还是由示踪剂粒子的调节引起的。

为了解决这些问题，L.J. Holt和B.D. Engel课题组开发了基因编码的多聚体（genetically encoded multimeric nanoparticles, GEM）纳米颗粒。顾名思义，GEM可以在细胞内表达，然后会自动组装成发光、稳定的蛋白复合体，是明确形状和大小的示踪剂颗粒。他们采用来自极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的capsulin蛋白【7】和来自极端嗜热细菌Aquifex aeolicus的lumazine合成酶复合物的支架结构域【8】作为示踪剂颗粒的骨架蛋白。该两个GEMs可以组装成35-nm和15-nm大小的二十面体笼状蛋白复合物。通过原位冷冻-ET（In situ cryo-electron tomography）镜检，确定Pyrococcus furiosus encapuslin GEM的直径为41 nm，略大于晶体学数据报道的35 nm直径可能是因为加了额外的T-Sapphire荧光分子的装饰，他们将这些颗粒称为为40nm-GEMs。使用负染技术，他们测量到A. aeolicus lumazine合成酶GEM的直径15nm（图1），与结晶学数据一致【8】。加上荧光分子T-Sapphire的修饰后，他们将这些颗粒称为20nm-GEMs（其中通过负染测得Pyrococcus furiosus encapuslin GEMs为37nm）。

图1. 40nm-GEMs 和20nm-GEMs纳米颗粒

20nm-GEMs和40nm-GEMs的大小与大多数多亚基组装体类似，如核糖体，蛋白酶体和染色质重塑复合物（图2），这使他们能够研究这些复合物在细胞内环境中经历的中等尺度微流变过程。

图2. GEMs和其他生物大分子的大小尺度

GEMs可快速表征细胞溶质在酵母和人类细胞中的流体学特性，其中一个主要的表征参数便是GEMs的扩散速率。他们在芽殖酵母和腺病毒转化的人胚肾细胞系（HEK293）中表达40nm-GEM（图3）发现，使用GEM作为微观流变学标准测得的实验数据与文献中的预期结果非常一致【9】。

图3. （A）酿酒酵母和（B）HEK293细胞中表达的40nm-GEMs。

接下来，他们发现了雷帕霉素复合物mTOR1（The mechanistic target of rapamycin complex, mTORC1）在影响细胞溶质生物物理特性中的重要作用。在酵母实验中，他们观察到当酵母营养接近饱和时，GEMs的有效扩散效率增加了。通过特异性地减少培养基的成分，他们发现氮和葡萄糖饥饿导致40nm-GEM的表观扩散略微减少（这也可以说得通，毕竟能量减少了）；然而，他们发现响应于氨基酸消耗而发生的有效扩散反而增加了。

这让他们想到了mTORC1可能在其中起调节作用，因为mTORC1是真核生物中主要的氨基酸感应器。他们假设mTORC1信号可能导致观察到的细胞质流变学变化。实验结果与他们的假设一致，在酿酒酵母和HEK293细胞中（图4D和E），当mTORC1被rapamycin抑制时，40nm-GEM的迁移率增加。在用rapamycin分别处理酵母和HEK293细胞2小时和3小时后，这种有效扩散的增加达到了最大效果，扩散系数的分布变化非常显着（图4F）。重要的是，cryo-ET显示40nm-GEMs在rapamycin处理后没有改变大小，即性质非常稳定，因此这并不是GEMs自身性质变化带来的影响。这些结果表明，mTORC1在控制酵母和哺乳动物细胞中40nm长度细胞溶质的生物物理特性中扮演着重要角色。

图4. 40nm-GEM有效扩散系数（Deff）的分布

他们筛选了多个机制去验证mTORC1是如何影响细胞流体学性质的。他们最终发现mTORC1是通过调节核糖体浓度来控制其中的变化。核糖体通常非常稳定，但饥饿条件，可以驱动自噬和核糖体加速降解，特别是当mTORC1被抑制时。由于核糖体约占细胞溶质总体积的20％，因此，其浓度的调节对细胞的生物物理特性具有显着影响：mTORC1的抑制可以使直径为不小于20nm的生物大分子颗粒有效扩散系数加倍。使用phenomenological Doolittle方程（请看原文材料方法），将示踪粒子的扩散与拥挤联系起来，能够预测有效扩散系数随细胞中核糖体浓度的变化而变化。原位cryo-ET技术显示mTORC1的抑制几乎使酿酒酵母胞质核糖体浓度降低一半（图5）。

图5. 酿酒酵母的原位Cryo-ET成像揭示了在mTORC1受抑制时核糖体浓度显着降低

最后，他们发现，不管是在酵母和HEK293细胞中，mTORC1调节的下游的核糖体浓度控制着相分离的变化，为细胞内拥挤效应和相分离之间提供了直接联系。总之，这些数据表明mTORC1通过调节核糖体浓度来控制大分子拥挤，从而调控相变的（图6和图7）。

图6. mTORC1在酿酒酵母和HEK293细胞中调节核糖体浓度的模型

他们使用原位cryo-ET成像发现核糖体在调节这些机制的过程中充当拥挤剂的角色，而mTORC1则是通过控制核糖体浓度调节相分离，这些结果确立了mTORC1在控制细胞质的中尺度生物物理特性和生物分子缩合中的作用 （图6和图7）。这项研究通过使用来自不同物种的细胞系（酵母和HEK293）研究生物的GEM，使粒子受特定相互作用影响的可能性大大降低；同时使GEM可以作为众多生物体的标准微流变工具，可用来研究细胞内的拥挤效应和相分离影响的其他生理过程。

图7. mTORC1调节核糖体浓度的图文模型。mTORC1的活性越高，核糖体浓度越高，通过GEM所表征的运动速率则越小；反之，mTORC1的活性被抑制，核糖体浓度降低，GEM所表征的运动速率则越大。而核糖体的浓度变化则会影响细胞内环境的相变过程。

该论文通讯作者L.J. Holt博士和B.D. Engel博士分别来自纽约大学和德国马普生化所，下面是他们的简介。

L.J. Holt博士：现在是纽约大学（NYU）的助理教授，独立PI。博士毕业于UCSF，主要研究方向包括癌症研究、细胞生物物理学、逆境细胞生物学、进化生物学及合成生物学等。目前已经在Nature、Science、Cell、Mol Cell、PNAS、elife等杂志发表论文十余篇。

B.D. Engel博士：博士毕业于UCSF，现在在马普生化所做博后。

参考文献：

1. Delarue, M., et al., mTORC1 Controls Phase Separation and the Biophysical Properties of the Cytoplasm by Tuning Crowding. Cell, 2018.

2.  Zhou, H.-X., G. Rivas, and A.P. Minton, Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences. Annu. Rev. Biophys., 2008. 37: p. 375-397.

3. Lohka, M.J. and J.L. Maller, Induction of nuclear envelope breakdown, chromosome condensation, and spindle formation in cell-free extracts. The Journal of cell biology, 1985. 101(2): p. 518-523.

4.  Banani, S.F., et al., Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell, 2016. 166(3): p. 651-663.

5. Daniels, B.R., B.C. Masi, and D. Wirtz, Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophysical journal, 2006. 90(12): p. 4712-4719.

6. Shav-Tal, Y., et al., Dynamics of single mRNPs in nuclei of living cells. science, 2004. 304(5678): p. 1797-1800.

7.  Akita, F., et al., The crystal structure of a virus-like particle from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus provides insight into the evolution of viruses. Journal of molecular biology, 2007. 368(5): p. 1469-1483.

8.  Zhang, X., et al., X-ray structure analysis and crystallographic refinement of lumazine synthase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus at 1.6 Å resolution: determinants of thermostability revealed from structural comparisons1. Journal of molecular biology, 2001. 306(5): p. 1099-1114.

9. Luby-Phelps, K., D.L. Taylor, and F. Lanni, Probing the structure of cytoplasm. The Journal of Cell Biology, 1986. 102(6): p. 2015-2022.

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