Cell丨谢琦博士等揭示DNA新修饰6mA在神经胶质瘤中的作用

撰文丨黄蔚

责编丨迦溆

图片引自：http://eureka.criver.com/brain-cancer/

相比通过影响RNA稳定性、翻译、可变剪接和定位参与生长发育以及癌症进程的表观遗传学热门选手——RNA m6A修饰，哺乳动物的DNA的6mA修饰研究显然冷清并且坎坷得多（一般DNA上的N6-甲基腺嘌呤称为6mA，而RNA的称为m6A）。

6mA是原核生物基因组DNA最常见的修饰。在限制修饰系统中，N4-methyldeoxylcytosine和6mA主要被原核生物用来保护自己的基因组免于外源DNA入侵。事实上，早在1968年来自国立莫斯科大学的研究人员就在Nature上发文报道了细菌DNA上除了有5mC修饰之外还有6mA修饰【1】。早些年也有不少报道表明在单细胞真核生物以及昆虫、有些植物中的基因组存在6mA修饰，这些成果当时也并没有引起同行的广泛关注。

真正把基因组6mA修饰研究推向高潮的是2015年Cell同期发表的三篇分别来自何川、施扬和陈大华课题组的工作，他们分别在藻类【2】、果蝇【3】、和线虫【4】的基因组中发现6mA。尽管这三篇文章把DNA 6mA修饰的研究推向了新的高度，但是仍然没有解决哺乳动物基因组中是否存在6mA修饰的核心问题。2016年3月，耶鲁大学的Andrew Z. Xiao等在Nature发表研究【5】，首次证明6mA在小鼠胚胎干细胞中存在。进一步，该研究发现6mA导致基因转录的抑制，并鉴定了6mA去甲基化酶ALKBH1（注意，此时6mA的甲基化酶尚未被鉴定）。然而一年后，2017年3月，Thomas Carell等人在Angewandte Chemie International Edition报道了相反的研究结果【6】：利用超灵敏的质谱技术并没有在小鼠的胚胎干细胞中发现6mA的存在。一时间，哺乳动物基因组上6mA的研究迷雾重重。但是，今年7月，来自广州医科大学的晏光荣和肖传乐合作组利用SMRT测序在人类基因组中鉴定到了6mA【7】，研究成果发表在Mol Cell上，一时间也引发了广泛的关注（Mol Cell丨晏光荣肖传乐等合作解码人类基因组新型甲基化修饰），因为过去几年有不少顶尖实验室尝试在人类基因组上寻找新的修饰，但是最终因为各种原因而放弃。晏光荣等人的研究首次鉴定到了N6AMT为6mA甲基化酶，并发现6mA水平在癌症中有明显的下调，提示6mA参与了癌症的发生发展【7】。特别值得一提的是，今年5月份，西奈山医学院的房刚课题组在Genome Research杂志上是首次运用单分子测序手段发现人类基因组中有6mA修饰【8】。

11月1，来自加州大学圣地亚哥分校的 Jeremy N. Rich课题组（Rich 研究组的项目科学家谢琦博士和博士生 Ryan Gimple 以及Xiao研究组的博后吴涛博士为该文的共同一作，吴涛已经入职贝勒医学院分子与人类遗传系）与耶鲁大学Andrew Z. Xiao课题组合作在Cell上发表了题为N6-methyladenine DNA Modification in Glioblastoma的研究成果，首次证明了人类神经胶质瘤细胞的基因组中有着丰富的6mA修饰，6mA修饰参与癌症的发展，并发现靶向6mA 去甲基化酶ALKBH1有望成为治疗神经胶质瘤新策略。

该研究取得的主要成果如下：

1、6mA在神经胶质瘤中显著高表达。

或许是为了回应Thomas Carell等人的质疑（全文并没有引用过他们的研究），研究者采用了3种方法在胶质瘤干细胞、原发胶质瘤和正常胶质细胞中鉴定6mA的水平，包括超高灵敏的质谱分析、dot blot和免疫组化。3种方法的结果都显示6mA在癌细胞中的水平显著高于正常细胞。这与晏光荣研究员发现6mA水平在癌症（胃癌和肝癌）中下降的现象相反（而且并不支持他们认为在人正常细胞中有很高丰度6mA的结论），说明不同癌症中6mA的水平，甚至是功能有可能不同。

6mA在人星型角质细胞种含量很低，而在胶质瘤干细胞中具有很高的丰度

2、 6mA与H3K9me3介导的异染色质结构有共定位。

异染色质呈固缩状态，是转录不活跃的区域，真核生物可以通过异染色质化关闭基因的表达，与之相对应的是常染色质。研究者利用6mA DIP-seq发现6mA大多位于异染色质区，并于已知的参与异染色质化的组蛋白H3K9me3修饰有明显的共定位。这说明与小鼠胚胎干细胞相似【5】，6mA在神经胶质瘤中也参与了基因的表达沉默，但是它是如何与H3K9me3互作的，还需进一步研究。

3、ALKBH1参与6mA水平的调控并成为治疗神经胶质瘤的靶标。

进一步，研究者想知道6mA在癌症中的具体功能，并很自然的想到利用敲低或者过表达6mA甲基化酶N6AMT和去甲基化酶ALKBH1实现。意外的是，在神经胶质瘤中敲除N6AMT并不影响6mA的水平，并且用纯化的N6AMT重组蛋白在体外in vitro条件下也不能影响6mA（这一点也与晏光荣课题组此前报道的N6AMT为6mA甲基化酶不相符），提示还有其他蛋白催化DNA 6mA修饰。研究者接下来主要研究去甲基化酶ALKBH1（2016年何川课题组在Cell上报道了ALKBH1能够去除tRNA的甲基化【9】）在神经胶质瘤中的作用。欣慰的是，与Andrew Z. Xiao研究结果一致，敲低ALKBH1确实可以提高6mA的水平，说明在神经胶质瘤中，ALKBH1也发挥6mA去甲基化酶的作用。

有趣的是，虽然6mA在神经胶质瘤中升高，但是敲低ALKBH1后，6mA上升，癌细胞的自我更新和成瘤能力却都降低了。ALKBH1竟然发挥癌基因的作用！进一步分析发现6mA富集的DNA区域主要是神经系统发育相关的基因，6mA导致这些基因沉默、抑制胶质细胞的分化以及促进癌症的发生。而ALKBH1主要作用于缺氧反应等癌基因，通过去除6mA，促进这些基因的表达，促进癌细胞的存活（图1）。但是关于ALKBH1是如何选择性的作用在这些基因位点，还有待进一步研究（这是整个6mA领域和m6A领域共同面临的问题）。

总的来说，这项研究是目前对6mA在癌症中的功能最全面和系统的研究，将开启6mA癌症研究的序幕，但同时也发现了新的问题。未来的研究需要更全面地鉴定6mA的甲基化酶和去甲基化酶（比如RNA m6A修饰，涉及多个甲基化酶和去甲基化酶），为6mA的功能研究打下基础，同时需要更仔细的分析6mA在各类癌症中的水平，以及它对靶基因的选择性是如何实现的。

参考文献

1.Vanyushin, B. F., Belozersky, A. N., Kokurina, N. A., & Kadirova, D. X. (1968). 5-Methylcytosine and 6-methylaminopurine in bacterial DNA. Nature, 218(5146), 1066.

2.Y. Fu, G. Z. Luo, K. Chenet al. N6-methyldeoxyadenosine marks active transcription start sites in Chlamydomonas. Cell，2015，161（4）：879-892

3. G. Zhang, H. Huang, D. Liuet al. N6-methyladenine DNA modification in Drosophila. Cell，2015，161（4）：893-906

4. E. L. Greer, M. A. Blanco, L. Guet al. DNA Methylation on N6-Adenine in C. elegans. Cell，2015，161（4）：868-878

5. T. P. Wu, T. Wang, M. G. Seetinet al. DNA methylation on N(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature，2016，532（7599）：329-333

6. S. Schiffers, C. Ebert, R. Rahimoffet al. Quantitative LC-MS Provides No Evidence for m(6) dA or m(4) dC in the Genome of Mouse Embryonic Stem Cells and Tissues. Angew Chem Int Ed Engl，2017，56（37）：11268-11271

7. C. L. Xiao, S. Zhu, M. Heet al. N(6)-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome. Mol Cell，2018，71（2）：306-318

8. Zhu, S., Beaulaurier, J., Deikus, G., Wu, T. P., Strahl, M., Hao, Z., ... & Fang, G. (2018). Mapping and characterizing N6-methyladenine in eukaryotic genomes using single-molecule real-time sequencing. Genome research.

9. Liu, F., Clark, W., Luo, G., Wang, X., Fu, Y., Wei, J., ... & He, C. (2016). ALKBH1-mediated tRNA demethylation regulates translation. Cell, 167(3), 816-828.

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