PNAS丨一石二鸟，吴海涛组揭示小脑发育新型关键调控分子

责编丨迦溆

小脑形态发生是脑发育的重要组成部分。值得一提的是，哺乳动物中构成小脑的主要细胞类型颗粒神经元数目占据大脑全部神经元数量的半数以上【1】。同大脑发育类似，小脑发育也严格按照早期神经干细胞发生、神经前体细胞增殖、迁移、分化和突触形成等进程依次进行。与之所不同的是，小脑体积的快速增加与形态发生主要在出生后完成。该过程受胞外包括Wnt、Shh、Reelin、FGFs等在内形态发生信号分子的精细调控，又依赖于核内DNA结合蛋白Gbx2、En1和Zic1/2等分子的作用。与此同时，神经干细胞（NSC）、颗粒神经元前体细胞（GNP）、浦肯野神经元和Bergmann胶质细胞等不同细胞亚型之间的相互作用，对于小脑经典分叶和“三明治”样分层结构（从外到内可分为分子层ML、浦肯野细胞层PCL和颗粒细胞层GCL）的塑造同样至关重要【2，3】（图1）。

近年来，围绕小脑发育调控的分子机制研究已取得若干进展，但其背后的精细时空调控机制仍不甚明了。比如：经典形态发生信号分子Wnt和Shh如何在胞内进行整合、调制从而精细调控不同发育阶段细胞的命运? Wnt和Shh信号下游具有转录激活功能的执行信号分子β-catenin和Gli1/2的活性如何调控？

围绕上述问题，军事医学研究院吴海涛课题组借助经典在体细胞特异性敲除和功能挽救实验，揭示了WD40重复结构域蛋白Rack1（The receptor for activated C kinase 1）在胚胎期和出生后调控小脑发育中发挥关键作用。通过一系列遗传学和生化实验证明Rack1可通过分别在NSC和GNP阶段特异性抑制经典Wnt/β-catenin而激活Shh信号通路方式发挥双向整合调制功能，并在维持NSC自我更新和促进GNP增殖迁移方面发挥决定性作用。2019年2月14日，该研究结果以直接投稿方式（Direct Submission Plus）在PNAS杂志在线发表，题目为Opposite regulation of Wnt/β-catenin and Shh signaling pathways by Rack1 controls mammalian cerebellar development【4】（图2）。

在该项研究中，研究人员首先发现Rack1蛋白在小脑发育阶段高表达，且同NSC标志物Pax6呈正相关，之后借助hGFAP-Cre，Atoh1-Cre和GLAST-CreERT2三种不同Cre小鼠和军事医学研究院张纪岩课题组提供的Rack1loxP/+小鼠，分别在NSC、GNP和Bergmann胶质细胞中特异性敲除Rack1后，系统比较了三种基因敲除小鼠小脑组织形态和各种不同细胞亚型表达的变化，并通过BrdU/EdU双标的方法观察了在不同发育阶段缺失Rack1后NSC自我更新和GNP增殖迁移的变化，发现Rack1主要通过影响NSC和GNP而非Bergmann胶质细胞发挥调控功能。此外，还发现Rack1可通过GNP以非细胞自主性方式影响小脑浦肯野神经元和Bergmann胶质细胞分化成熟，从而证实了Rack1参与调控GNP增殖、迁移和分化成熟在小脑发育进程中的关键作用。

机制研究方面，研究人员通过在体和离体实验发现，在NSC和GNP中特异性敲除Rack1可导致Wnt/β-catenin信号通路过度激活而Shh信号通路显著受到抑制。非常有意思的是，当研究人员分别在NSC和GNP中采用Rack1和β-catenin双敲除策略进行“功能挽救”实验时发现，只有在NSC而非GNP中特异性双敲除Rack1和β-catenin能够显著“挽救”Rack1突变小脑发育缺陷表型，从而在遗传学层面首次证实Rack1可通过负调控NSC中Wnt/β-catenin信号活化影响NSC自我更新和命运决定控制小脑的形态发生（图3）。

接下来，研究人员通过一系列细胞和生化实验进一步证实，小脑GNP中Rack1可通过直接结合Shh信号通路关键受体Smoothened介导其活化，与此同时，Rack1还可通过增加组蛋白去乙酰化酶HDAC1/2蛋白稳定性对Shh下游信号分子Gli1激活发挥间接调控作用。当新生鼠颅内给予HDAC1/2药理学抑制剂romidepsin时能够显著抑制GNP增殖和小脑分叶形成。前期研究表明，HDAC1/2可结合Gli1/2并通过降低其乙酰化水平增强其转录活性【5】。结合本研究结果，进一步证实，Rack1可通过直接参与或间接调控两种方式激活GNP中Shh信号通路影响小脑发育进程。需指出，近期复旦大学解云礼课题组在Neuron杂志上发表的研究结果也证实在大脑皮层发育过程中HDAC1/2可通过对SVZ区中间前体细胞（IP）在时空上进行精准调控进而决定大脑皮层发育【6】，提示HDAC1/2在调控神经系统发育过程中存在功能保守性。

综上所述，该研究揭示了WDR家族成员Rack1整合Wnt/β-catenin和Shh信号通路调控小脑形态发生的新功能及其作用机制。由于小脑颗粒细胞的异常增生可导致髓母细胞瘤发生，临床上髓母细胞瘤的四种分子分型诊断中就包含Wnt和Shh两种亚型，且HDACs已成为临床前抗髓母细胞瘤的潜在靶点，本文所揭示的小脑发育过程中Rack1介导HDAC1/2稳定性并调控Wnt/β-catenin和Shh信号稳态的结果对于深入理解小脑髓母细胞瘤的发生机理并寻找新的干预靶点亦具有重要参考价值。

据悉，军事医学研究院军事认知与脑科学研究所吴海涛研究员和张纪岩研究员为本论文共同通讯作者，吴海涛课题组杨海红博士和朱倩博士为本文共同第一作者。

原文链接：

https://www.pnas.org/content/early/2019/02/13/1813244116.abstract

制版人：子阳

参考文献

1.    Herculano-Houzel, S. and R. Lent, Isotropic fractionator: a simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. J Neurosci, 2005. 25(10): p. 2518-21.

2.    Sillitoe, R.V. and A.L. Joyner, Morphology, molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum. Annu Rev Cell Dev Biol, 2007. 23: p. 549-77.

3.    Butts, T., M.J. Green, and R.J. Wingate, Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain'. Development, 2014. 141(21): p. 4031-41.

4．    Yang, H., et al., Opposite regulation of Wnt/β-catenin and Shh signaling pathways by Rack1 controls mammalian cerebellar development. PNAS, 2019.

5.    Canettieri, G., et al., Histone deacetylase and Cullin3-REN(KCTD11) ubiquitin ligase interplay regulates Hedgehog signalling through Gli acetylation. Nat Cell Biol, 2010. 12(2): p. 132-42.

6.    Tang, T., et al., HDAC1 and HDAC2 Regulate Intermediate Progenitor Positioning to Safeguard Neocortical Development. Neuron, 2019.

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