专家点评Science | 小分子，大作为：邓宏魁/卢实春/袁正宏合作团队突破人肝细胞体外长期培养瓶颈

编者按

由于缺乏适当的培养条件与微环境，体外源于干细胞诱导分化所获得的功能细胞，很难真正成熟并长期维持其功能，是再生医学研究和应用中长期面临的挑战。在过去的几十年里，人们尝试了改变培养材料，共培养以及三维培养等很多方法，但始终未能建立一个简单高效，稳定的功能细胞体外培养体系。为解决这一问题，邓宏魁研究组等以体外培养过程中快速失去功能的人原代肝细胞为研究对象，筛选到5种化学小分子的组合并利用它们在体外成功实现了肝细胞功能的长期维持。在长达一个月以上的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内的肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞的功能。相关工作于2019年4月26号在线发表于Science杂志上。鉴于该工作的突破性意义，BioArt特别邀请到了乙肝病毒专家、中国工程院院士闻玉梅教授以及从事肝脏疾病相关研究的孙序序研究员对上述工作进行了点评，以飨读者！

点评 | 闻玉梅（中国工程院院士）、孙序序（上海交通大学基础医学院）

撰文 | 珊今

责编 | 兮

据统计，全球遭受肝脏疾病困扰的人约有10亿，其中约4亿来自于中国【1】，因此寻找有效的肝病治疗方法对于全人类尤其是对于中国来说显得极为迫切。肝脏疾病的研究一直缺乏良好的体外模型，人肝原代细胞（Primary human hepatocytes , PHHs)本应该是理想的模型，但是其在体外培养条件下在很短时间内就会发生形态变化，丧失肝细胞功能进而发生衰老和死亡。体外长期培养人原代肝细胞并维持其成熟功能一直是领域里的瓶颈所在。

2017年，一些研究组利用去分化为肝前体细胞状态的方法在体外培养大鼠和小鼠肝细胞获得成功【2,3】，人们看到了实现人原代肝细胞体外培养的可能性。2018年11月，惠利健研究组与合作者在Cell Stem Cell上发表论文，该研究实现了人肝细胞的体外扩增，并证明了增殖的肝细胞体内功能与人原代肝细胞接近【4】。以上的研究都涉及到了细胞的去分化，因此是否存在更简单高效安全的方法实现人原代肝细胞长期培养并维持其成熟功能呢？

化学小分子诱导重编程从问世之初一直受到大家关注，相比于传统转基因方法介导的重编程，化学小分子不但可以避免内源基因修改带来的风险，它同时兼具了细胞膜穿透性、可逆性、可控性和易于制造等诸多优点。早在2013年，北京大学邓宏魁教授团队于在Science上发表文章，报道了他们建立了一套完整可靠的小分子重编程方法，首次利用小分子化合物将体细胞重编程为多潜能干细胞（chemically iPSC, CiPSC）【5】；此后该团队相继利用小分子诱导皮肤成纤维细胞为功能神经元细胞(CiN）【6】；建立了具备全能性功能特征的多潜能干细胞(EPS细胞)【7】。

2019年4月26日，邓宏魁教授与中国人民解放军总医院卢实春教授、复旦大学袁正宏教授在Science上发表了题为Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro的研究成果，仅利用5种化学小分子就实现了体外肝细胞功能的长期维持。这些工作表明了化学小分子在精细调控细胞命运和功能上的优越性，这一方法也为其他类型细胞体外功能的长期维持提供了新的途径。

在这项研究中，研究者们首先比较了新鲜获得的人肝原代细胞以及在体外培养了24小时的细胞的转录谱差别，他们发现转化生长因子β（TGF-β）通路以及上皮间充质转换（EMT）诱导子的相关基因在培养24小时后的人肝原代细胞中发生了显著的变化，随后他们测试了这些通路相关的小分子抑制剂，并找出了五种关键的小分子抑制剂：FSK, SB43, DAPT, IWP2和LDN193189，被他们称作5C。

5C处理使人肝原代细胞得在体外长期培养下保持正常形态和增殖特性

后续的研究发现，5C处理使得人肝原代细胞在长期体外培养条件下保持了原有的正常形态，并且通过检测mRNA水平，发现5C处理后保持了肝细胞原有的基因表达模式。因为肝脏是重要的解毒以及代谢器官，研究者们还检测了用5C处理的肝原代细胞中CYP（Cytochrome P450）基因的表达及其酶活性，发现相较于新鲜提取的肝原代细胞均没有明显差别。值得一提的是，在长达一个月以上的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内的肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞的功能。

那么这种5C处理的肝细胞有没有可能作为一种药物筛选平台呢？邓宏魁研究组与袁正宏研究组合作，基于5C培养条件，成功建立了乙型肝炎病毒感染模型：持续高水平表达乙肝表面抗原、e抗原、合成乙肝病毒DNA等感染指标，尤其是能够长期稳定产生乙肝病毒复制必需的cccDNA。这一模型的建立，对于乙肝病毒的深入研究与药物研发具有重要意义。

我国约有1.2亿人携带乙肝病毒,目前仍然没有有效的治愈方法。因为乙肝病毒侵入肝细胞后,形成了一种很难被清除的病毒复制模板cccDNA,目前还没有针对这个病毒复制关键靶点的药物。相形之下，丙型肝炎病毒的发现虽然晚于乙肝病毒，但基于有效的体外病毒感染模型，已成功筛选并获得治愈丙肝的药物。5C培养条件下的肝细胞支持乙肝病毒的高效感染，并能够长期产生cccDNA，可作为理想的药物筛选模型,为治愈乙型肝炎带来希望。

总之，这种仅用5种化学小分子处理来体外长期培养人肝原代细胞的方法易于实现，极适用于药物的高通量筛选，为肝脏疾病的治疗提供了更为简便的研究工具，具有重大的现实意义。

据悉，北京大学邓宏魁教授、解放军总医院卢实春教授以及复旦大学袁正宏教授为该论文的共同通讯作者，向晨罡博士、杜媛媛博士以及孟高帆博士为该论文的共同第一作者。

原文链接：

https://science.sciencemag.org/content/364/6438/399

参考文献

1    Wang, F. S., Fan, J. G., Zhang, Z., Gao, B. & Wang, H. Y. The global burden of liver disease: the major impact of China. Hepatology 60, 2099-2108 (2014).

2    Katsuda, T. et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell 20, 41-55 (2017).

3    Wu, H. et al. Reversible transition between hepatocytes and liver progenitors for in vitro hepatocyte expansion. Cell research 27, 709 (2017).

4    Zhang, K. et al. In vitro expansion of primary human hepatocytes with efficient liver repopulation capacity. Cell stem cell 23, 806-819. e804 (2018).

5    Hou, P. et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 341, 651-654 (2013).

6.   Hu, W., Qiu, B., Guan, W., Wang, Q., Wang, M., Li, W., ... & Deng, H. (2015). Direct conversion of normal and Alzheimer’s disease human fibroblasts into neuronal cells by small molecules. Cell stem cell, 17(2), 204-212.

7. Yang, Y., Liu, B., Xu, J., Wang, J., Wu, J., Shi, C., ... & Deng, H. (2017). Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extraembryonic potency. Cell, 169(2), 243-257.

专家点评

闻玉梅（中国工程院院士、复旦大学上海医学院教授，病毒学家，长期从事乙型肝炎病毒持续性感染机理及对策相关研究）

由邓宏魁、卢实春、袁正宏作为共同通讯作者发表于《科学》杂志（Science）的论文:“体外长期维持原代肝细胞功能”,是我国学者研究乙肝、丙肝以及其他肝脏疾病的机理的一项重大突破。作者们通过用FSK, SB431542, DAPT, IWP2及LDN193189五种化合物，成功地实现了在体外将人肝细胞延长培养至4周。用此技术体外培养的肝细胞，不仅保持了肝细胞的生理功能，最有意义的是，这些在体外维持数周的肝细胞可成功地被乙肝病毒感染，表达HBsAg与HBeAg。通过对比，发现乙肝病毒与丙肝病毒感染过程有较大不同。这一研究最重要的价值是细胞被乙肝病毒感染后，可以完成整个病毒复制周期，包括产生共价闭合环状DNA（cccDNA）；而 cccDNA正是目前乙肝病毒难以被清除，疾病难以被治愈的关键。通过这一平台，将可更深入提出解决cccDNA的策略。作者们还在这一平台上，对现有临床实用的抗乙肝病毒核苷类药物与干扰素进行了考核，证实了核苷类药物可抑制经细胞培养的乙肝病毒，经干扰素处理后细胞可上调干扰素激活的基因控制乙肝病毒。用此建立了较长期的人肝细胞体外培养平台，不仅将为研究乙肝治愈推进一大步，还提供了创新性研发抗肝炎病毒药物的重要工具。

专家点评

孙序序（上海交通大学基础医学院研究员，长期从事肝脏疾病相关研究）

肝脏是体内重要的器官，负责代谢、解毒、造血凝血、免疫等功能。肝细胞是占肝脏80-90%的肝实质细胞，是肝脏功能的主要承担者。原代肝细胞分离和体外培养为模拟肝脏疾病和分子机制研究提供了重要方法和材料。但是新鲜分离得到的原代肝细胞体外培养只能维持10-14天，在这过程中肝细胞功能会快速丧失，随后变成纤维样间质细胞，最后发生细胞凋亡。这对于体外操作细胞并精确模拟体内疾病和分子机制研究带来困难。因此，如何保持肝细胞在体外长期培养过程中性状稳定并与体内功能一致，是肝脏研究领域长期未解决的问题和难题。

最近一期Science上报道北京大学邓宏魁教授研究组等发现利用五种小分子化合物组合处理实现在体外长期培养肝细胞时稳定保持其功能的新方法。该研究首先从比较新鲜分离的人原代肝细胞与培养24小时后的肝细胞转录表达谱入手，发现体外培养24小时后肝细胞基因表达即发生变化，有15个主要的肝功能相关基因被下调达10倍。同时TGF-信号通路被上调，提示原代肝细胞体外培养24小时即触发启动上皮-间质转化程序，推动细胞命运改变，正常肝细胞功能走向丧失。随后通过加入TGF-小分子抑制剂SB431542可以保持一定的上皮细胞性状但是仍不能阻止肝功能相关基因表达被下调，提示仍存在其他负向调控肝细胞稳定的信号。研究组继续通过小分子药物筛选，最终发现在体外培养液中加入5种化合物组合：FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189，可以很好地延长培养时间至四周，并在此期间有效保持肝细胞极性性状和肝功能相关基因的稳定表达。这5种化合物分别为cAMP激动剂，TGF-抑制剂，Notch抑制剂，Wnt抑制剂和BMP抑制剂，这些信号通路主要涉及到肝细胞细胞转化、增殖等过程，而抑制剂的加入可能模拟体内微环境中所释放信号的综合效应，达到维持肝细胞稳态的作用。

通过这种化合物组合稳定的体外培养原代肝细胞可以用来进一步进行体外肝脏功能及机制研究。作者首先验证了肝细胞药物解毒的功能，发现肝细胞解毒特异酶CytochromeP450 家族成员都保持了与新鲜肝细胞同等的药物代谢活性。

除此之外，研究组发现这些延长培养的肝细胞持续稳定表达乙肝病毒HBV受体蛋白NTCP，提示其可作为研究HBV感染的体外模型。HBV感染是我国肝炎和肝癌发生的主要原因，但是由于HBV感染具有严格的种属特异性，使得包括小鼠在内的动物模型并不能感染人HBV，这是长期以来人HBV病毒感染基础研究的障碍。在本研究中，作者通过利用HBV感染证明这些稳定培养的肝细胞可以准确模拟体内HBV感染进程。除此之外，西方人群中较常见的丙肝病毒HCV感染也可以在这些细胞中有效进行，并且当用抗HCV病毒药物daclatasvir处理时肝细胞可以对药物做出反应。

该项研究首次发现了5种小分子化合物组合应用可以有效延长原代肝细胞体外培养时间并保持其生物学功能稳定，在时间上和功能上均保证了其作为体外模拟病毒感染模型的可行性。这对于探索病毒感染机制具有重要意义，也将为大规模抗病毒药物筛选提供新方法。未来这项体外延长培养的肝细胞是否可应用于其他肝脏疾病体外模拟、干预和基因操作等分子研究值得一步探索。

参考文献

1. Puviani, AC, Ottolenghi, C, Tassinari, B, Pazzi, P and Morsiani, E.An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comp Biochem Physiol A., 1998, 121: 99–109.

2. Sezin Aday, Nesrin Hasirci & Ismet Deliloglu Gurhan. A cost-effective and simple culture method for primary hepatocytes. Animal Cells and Systems 2011, Vol. 15, No. 1.

3. Wang FS 1, Fan JG , Zhang Z , Gao B , Wang HY . The global burden of liver disease: the major impact of China. Hepatology .  2014 Dec;60(6):2099-108.

4. Hui-Ling Chen, et al. Long-Term Culture of Hepatocytes from Human Adults.  Jounal of biomedical science,1998 5:435-440.

5. Meritxell Hu, et al Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver. Cell.  2015 160(1-2):299-312.

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