专家点评| Brian Kobilka等两篇Cell揭示GPCR-G蛋白的时序组装

点评 | 王明伟（中国科学院上海药物研究所/复旦大学药学院），叶德全（香港中文大学深圳校区生命与健康科学学院），孙金鹏（山东大学医学院/北京大学医学部）

责编 | 兮

G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor，GPCR）是人类基因组编码的最大膜蛋白超家族，该家族约含有800多个G蛋白偶联受体（GPCR）成员。GPCR在结合气味分子、激素、神经递质、趋化因子等配体后被激活，通过复杂的信号转导和调控机制对人体生理代谢的几乎各个方面产生重要影响。同时，GPCR还是最大类别的药物靶点之一，现今医药市场约40%的药物分子以GPCR作为作用靶点。

斯坦福大学Brian Kobilka教授由于揭示了GPCR工作的机制于2012年获得诺贝尔化学奖。2007年和美国Scripps研究所Raymond Stevens教授合作解析第一个实体配体GPCR-beta2肾上腺素受体（b2 adrenergicreceptor, b2AR）晶体结构以来【1】，Kobilka研究组一直专注以b2AR为模式受体解析了一系列重要构象状态的GPCR结构。特别是在2011年解析了第一个GPCR-G蛋白信号分子复合物的晶体结构，为研究GPCR信号转导奠定了基础【2】。G蛋白、arrestin和GRK是应答与调控GPCR活性的三类最基本的蛋白家族。在报道第一个GPCR-G蛋白复合物晶体结构以来，Kobilka教授围绕这三大类信号分子复合物开展更深入的研究工作，并持续性报道了一系列相关的科研成果。比如2017年围绕GPCR-GRK复合物和Thomas Jefferson University的Jeffrey Benovic研究组合作发表在Cell的论文（杜洋博士和Komolov博士作为共同第一作者）【3】。

目前解析的b2AR-Gs晶体结构只是代表了GPCR和G蛋白处于nucleotide-free瞬时状态下的构象。2011年Kobilka研究组在Nature发表运用氢氘交换质谱（Hydrogen-Deuterium ExchangeMass Spectrometry, HDX-MS）研究稳态下GPCR和G蛋白组装过程的构象变化（KaYoung Chung为论文第一作者）【4】。但是GPCR同G蛋白的结合或者解离是瞬时并且高度动态的过程。之前对于GPCR如何与Gs启动组装驱使GDP释放和此复合物如何释放GTP的相互作用动力学细节并没有答案，这已经成为GPCR乃至细胞信号转导领域一个有广泛兴趣的生物学问题。

2019年5月9日，斯坦福大学Brian Kobilka研究组、成均馆大学KaYoung Chung研究组和凯斯西储大学David Lodowski研究组通力合作在Cell在线发表了题为Assembly of aGPCR-G protein Complex的研究论文，首次报道了运用脉冲型氢氘交换质谱（Pulsed HDX-MS）和X射线辐射裂解蛋白印记（X-rayFootprinting）质谱技术分析研究b2AR-Gs复合物组装过程的动力学信息。

脉冲型(Pulsed)HDX-MS或X-ray Footprinting-MS是基于传统稳态(Continuous)原理的新质谱技术。它是在蛋白-蛋白结合或者分离阶段不同时间点快速取样进行质谱分析，提供了一种研究蛋白相互作用动力学信息的有力手段。借助脉冲型HDX-MS这一技术，研究者阐明了b2AR与Gs在秒级时间尺度是如何相互作用的。作为脉冲型HDX-MS很好的补充手段，同步辐射X-ray Footprinting(XFP)是覆盖毫秒级时间尺度蛋白质相互作用非常前沿的技术手段。论文第一作者Kobilka研究组的杜洋博士前往美国布鲁克海文国家实验室NSLS-II同步辐射光源XFP线站开展更深入研究，探究清楚了b2AR与Gs毫秒级分辨率下的分子作用事件。这样就完整揭示出GPCR和G蛋白最快从10毫秒直到分钟级的一系列节点动力学关键信息。进而借助放射性GDP释放技术和构建Gs突变体等其它功能分析，获得了此复合物如何时序组装的动力学和关键结构单元信息，提出了之前晶体结构没有揭示的GPCR如何通过G蛋白传导信号的分子机制。这加深了对于一般性GPCR和G蛋白复合物相互作用的整个过程理解。

另外，Kobilka教授（在清华的实验室）和清华大学刘翔宇助理研究员同期背靠背发表了另外一篇题为StructuralInsights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation的研究论文，杜洋博士也作为共同作者参与该项研究。两篇论文相互支持印证，共同揭示了GPCR-G蛋白在晶体或电镜结构里代表构象状态之前，两者如何时序组装的动力学机制。

这篇论文报道了两个结构。第一个是3.7埃β2AR-T4L-GsCT-CC结构，即将Gs蛋白羧基端的14个氨基酸（GsCT）融合在β2 肾上腺素受体的胞内第三个环状区域，并引入二硫键将GsCT稳定在其结合位置，获得 β2 肾上腺素受体激活态下的晶体结构。该课题原计划发展一种通用的稳定GPCR激活态构象的方法。但是在结构解析后发现 Gs蛋白羧基端与受体相互作用的方式不同于2011年解析的β2AR-Gsempty复合物（PDB：3SN6）。Gs蛋白羧基端的两个带电的氨基酸E392Gs和R389Gs与受体相互作用，而在之前的β2AR-Gsempty复合物中与受体结合的两个氨基酸Y391Gs和H387Gs却指向了相反的方向。分子动力学模拟表明这种结合方式几乎与β2AR-Gsempty的复合物中观察到的结合方式一样稳定。

论文报道的另一个结构是2.8埃的GDP结合状态下Gs蛋白（GsGDP）的晶体结构，在该结构中，Gs蛋白羧基端的Y391Gs和H387Gs与Gs蛋白内部其它氨基酸形成了相互作用，而E392Gs和R389Gs则暴露在Gs蛋白的表面。因此推测E392Gs和R389Gs 更有可能参与GPCR受体与G蛋白之间的初始相互作用。随后研究组通过多种生物化学手段和分子动力学模拟验证了E392Gs和R389Gs 在受体与G蛋白形成复合物过程中的重要作用。最后研究组搭建了beta2 肾上腺素受体与GDP结合状态下Gs蛋白的复合物（β2AR-GsGDP）的模型，并提出了从 GsGDP，到β2AR-GsGDP，最后到β2AR-Gsempty的复合物形成的动态模型。

专家点评

王明伟（中国科学院上海药物研究所/复旦大学药学院）

G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor，GPCR）是人类基因组编码的最大膜蛋白超家族和为数最多的药物靶点类别。此类受体结合配体后通过复杂的信号转导机制调节人体的生理功能。现有药物中约有40%作用于GPCR。作为GPCR结构生物学的翘楚，美国斯坦福大学Brian Kobilka（布莱恩·科比尔卡）教授近年来在G蛋白、Arrestin和GRK这三种应答与调控GPCR活性的蛋白复合物家族结构研究方面取得了一系列重要成果。然而，既往解析的受体晶体结构只展现了GPCR和G蛋白处于nucleotide-free状态下的瞬时构象。2011年，Kobilka研究组运用氢氘交换质谱技术（Hydrogen-Deuterium ExchangeMass Spectrometry, HDX-MS）阐明了稳态下GPCR和G蛋白组装过程的构象变化。由于GPCR和G蛋白的结合或解离是一个瞬时和动态的过程，之前对GPCR如何与Gs启动组装驱使GDP释放和此复合物如何释放GTP的分子动力学细节缺乏了解。因此，认识GPCR与G蛋白复合物相互作用的动力学特征不仅有助于理解GPCR-G蛋白特异性结合的分子机制，而且能为设计偏向不同亚型G蛋白的配体分子奠定基础。

2019年5月9日，Kobilka团队联合成均馆大学Ka Young Chung研究组和凯斯西储大学David Lodowski研究组在Cell 在线发表了题为《G蛋白偶联受体-G蛋白复合物的组装》（Assembly of a GPCR-Gprotein Complex）的论文，首次报道了运用脉冲式氢氘交换质谱（Pulsed HDX-MS）和X射线辐射裂解蛋白印记（X-ray footprinting）质谱分析技术研究b2-肾上腺素受体（b2AR-Gs）复合物组装过程的动力学过程，揭示了b2AR与Gs在毫秒级分辨率下的分子作用事件，并借助放射性GDP释放和构建Gs突变体等功能分析手段，获得了该复合物时序组装的结构单元和动力学信息，阐明了之前晶体结构未能展现的G蛋白转导信号的分子机制。这项成果加深了我们对GPCR与G蛋白相互作用过程的认识。该论文的第一作者杜洋博士曾在Kobilka教授指导下研学，最近加盟香港中文大学深圳校区生命与健康科学学院。

专家点评

叶德全（香港中文大学深圳校区生命与健康科学学院）

G蛋白偶联受体（GPCR）是人体内最大的膜蛋白受体家族，因其在生理和病理过程中发挥重要的作用而受到广泛的关注并成为许多药物的靶标。数百个GPCR与多个不同家族的G蛋白结合，在激动剂配体的刺激下，G蛋白活化并产生细胞内信号，进而转化为多种细胞功能。数十年来，G蛋白被认为是一个“分子开关”，控制着许多细胞功能的活化及失活过程。然而不同家族的G蛋白如何与GPCR结合一直未得到满意的解答，其原因之一便是G蛋白本身可存在于不同的状态，包括与GPT（三磷酸鸟苷）结合的状态，与GDP（二磷酸鸟苷）结合的状态，以及无核苷酸结合的状态。近年来数十个GPCR的三维结构得到解析，但因为技术手段的限制，目前已解析的GPCR与G蛋白结合的复合物结构中，其G蛋白均处于无核苷酸结合的状态。由于这一状态仅存在于体外实验条件中，所以不能准确地反映活细胞内GPCR如何与不同的Ｇ蛋白结合。

本期《细胞》杂志 (Cell) 发表的由杜洋博士等为第一作者、David Lodowski,Brian Kobilka, Ka Young Chung 为通讯作者的论文，首次从结构生物学的角度证明，GPCR与无核苷酸状态G蛋白结合之前存在一个过渡状态，而代表这一过渡状态的受体与G蛋白复合物并不稳定，且可影响GPCR结合不同家族G蛋白的选择性。由于复合物结构的不稳定性，解答这一问题需要采用不同的实验手段。杜洋博士等采用了脉冲型氢氘交换质谱分析和X射线辐射裂解蛋白印记质谱分析等手段，摄取毫秒级时间尺度上的蛋白结构变化，从而获得了支持上述推断的实验数据。在同一期《细胞》杂志中，由清华大学刘翔宇助理研究员及斯坦福大学Brian Kobilka教授等共同完成的另一篇论文，采用Gs蛋白羧基端肽段融合等实验方法，发现了同一受体与不同状态下G蛋白结合的结构生物学基础。两篇论文在同一期《细胞》杂志上发表，将有助于推动GPCR结构生物学研究向G蛋白与受体结合机制的方向发展，亦反映了Kobilka 研究团队在研究GPCR结构与活化机制上新的突破。杜洋博士将在香港中文大学深圳校区继续拓展结构生物学、生物物理实验手段在GPCR研究中的基础和转化研究。

专家点评

孙金鹏（山东大学医学院/北京大学医学部）

人体里含有800多个G蛋白偶联受体（GPCR）超家族的成员，感知包括气味分子、激素、神经递质、趋化因子等信号，从而调节生理反应。GPCR也是重要的药物靶点，有大约30%的临床药物直接与GPCR相互作用。

GPCR如何激活G蛋白的信号转导过程是一个重要的基本信号转导现象，也是结构生物学研究中的一个难点和热点。受体与G蛋白复合物的晶体结构首先由布莱恩·科比尔卡（Brian K. Kobilka）教授在2011年获得。该工作报道了由纳米抗体稳定的β2肾上腺素受体（β2AR）/Gs蛋白的复合物的结构。在该研究中，为了获得稳定的β2AR-Gs复合物样品，研究者们使用核苷酸酶Apyrase处理样品，将复合物稳定在无核酸结合的状态（β2AR-Gsempty）。在那以后，Apyrase处理的方法成为了制备GPCR-G蛋白复合物的标准方法。目前在PDB数据库中有超过10个不同GPCR-G蛋白复合物的结构，所有的结构都被稳定在无核酸结合的状态。然而，不少证据表明GPCR与G蛋白形成无核酸状态复合物（GPCR-Gempty）之前，存在一个中间态的GPCR与GDP结合的G蛋白的复合物（GPCR-GGDP）。但是GPCR-GGDP复合物稳定性较差，目前没有关于该复合物的结构信息。GPCR-GGDP复合物的结构可能是我们理解GPCR和G蛋白特异性识别的关键。因为特异性识别更有可能发生在GPCR和G蛋白形成复合物的初期阶段。

在本期Cell文章《G蛋白偶联受体- G蛋白复合物形成过程的结构机理》（StructuralInsights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation）里，布莱恩·科比尔卡教授与刘翔宇助理研究员报道了两个结构：分别是 β2AR融合Gs蛋白羧基端肽段（GsCT）的激活态的晶体结构（β2AR-T4L-GsCT-CC）和GDP结合状态的Gs蛋白结构（GsGDP）。在β2AR-T4L-GsCT-CC结构中他们发现GsCT与β2AR的结合方式不同于2011年解析的β2AR-Gsempty结构。在该结构中两个带电荷的氨基酸R389和E392参与结合β2AR，而在β2AR-Gsempty结构中，则是由螺旋反面的两个氨基酸H387和Y391参与结合β2AR。在GsGDP结构中，他们发现R389和E392暴露在Gs蛋白表面，而H387和Y391却没有。因此R389和E392更有可能参与与GPCR的早期相互作用。他们通过一系列的生化和药理实验证明R389和E392的突变会影响Gs和β2AR的相互作用。他们推测在β2AR-T4L-GsCT-CC结构中发现的GsCT和β2AR相互作用的方式可能代表在β2AR-GsGDP复合物状态下Gs和β2AR结合的方式，并依此搭建了β2AR-GsGDP的结构模型。有意思的是，β2AR会受到胰岛素受体酪氨酸激酶的磷酸化，从而表现出超敏化的现象。这个机理用β2AR-Gsempty结构不太好解释，而用本文中的β2AR-GsGDP可以较好的解释。

这个工作首次揭示了GPCR和G蛋白结合初始状态可能的分子结构。结合在同期Cell上以‘背靠背’形式发表的题为《G蛋白偶联受体-G蛋白复合物的组装》(Assembly of a GPCR-Gprotein Complex)的研究论文，共同揭示了GPCR 与G蛋白复合物形成的动态过程，因此对我们理解受体如何激活G蛋白这一基本的信号转导过程是一个显著的进步。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.022

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.021

制版人：小娴子

参考文献

1. Rosenbaum, D.M., Cherezov,V., Hanson, M.A., Rasmussen, S.G., Thian, F.S., Kobilka, T.S., Choi, H.J., Yao,X.J., Weis, W.I., Stevens, R.C., and Kobilka, B.K. (2007). GPCR engineeringyields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptorfunction. Science 318, 1266–1273.

2. Rasmussen, S.G., DeVree,B.T., Zou, Y., Kruse, A.C., Chung, K.Y., Kobilka, T.S., Thian, F.S., Chae,P.S., Pardon, E., Calinski, D., et al. (2011). Crystal structure of the b2adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature 477, 549–555.

3. Komolov KE, Du Y, Duc NM,Betz RM, Rodrigues JPGLM, Leib RD, Patra D, Skiniotis G, Adams CM, Dror RO,Chung KY, Kobilka BK, Benovic JL. (2017). Structural and Functional Analysis ofa β2-Adrenergic Receptor Complex with GRK5. Cell. 2017 Apr20;169(3):407-421.e16.

4. Chung, K.Y., Rasmussen,S.G., Liu, T., Li, S., DeVree, B.T., Chae, P.S., Calinski, D., Kobilka, B.K.,Woods, V.L., Jr., and Sunahara, R.K. (2011). Conformational changes in the Gprotein Gs induced by the b2 adrenergic receptor. Nature 477, 611–615.

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