Cell | 颜宁组解析结合配体的哺乳动物控钙离子通道结构

撰文 | 小白薯

责编 | 兮

动作电位是神经传导、肌肉收缩的重要生理过程，由电压门控离子通道感受。电压门控离子通道是一大类位于细胞膜上、控制离子跨膜进出细胞的蛋白质，包括钙、钾、钠离子通道。电压门控离子通道的功能异常或紊乱与一系列疾病相关，目前是仅次于G蛋白偶联受体（GPCR）的第二大药物靶点。Cav通道可特异性传递钙离子，在胞内，钙离子本身作为信号转导的第二信使，将细胞膜两侧的电信号转化为胞内的化学信号，对神经递质传递、肌肉收缩、基因转录、腺体分泌、自闭症谱系障碍、帕金森病等许多生理功能非常重要。

2015年1月，颜宁教授课题组在Nature杂志报道了下游肌质网膜上的高通量钙离子通道兔源RyR1的3.8 Å冷冻电镜结构【1】；12月，在Science杂志报道了电压门控钙离子通道兔源Cav1.1的4.2 Å分辨率冷冻电镜结构【2】；2016年9月，颜宁组再次在Nature杂志发表论文，将兔源Cav1.1结构的分辨率提升至3.6 Å的近原子分辨率，使大部分氨基酸的侧链能够被清晰分辨【3】；10月，在Science杂志再次报道了猪源RyR2的结构【4】。这些结构的解析为理解众多重要生理、病理功能和电压门控离子通道的工作机理奠定了基础，为利用结构进行新型药物设计、筛选和优化提供了参考模板。

2019年5月30日，颜宁课题组（吴建平博士为共同第一作者和共同通讯作者，现为西湖大学PI）在Cell上发表题为Molecular Basis for Ligand Modulation of a Mammalian Voltage-Gated Ca2+ Channel的研究长文，通过Cryo-EM解析了兔源Cav1.1结合不同拮抗剂和激动剂的高分辨率结构，为进一步理解相关药物的作用机制、在结构上提供实验和临床数据、对进一步的药物设计提供了重要依据。

在哺乳动物中，共有10个Cav通道，分为三个亚型：Cav1（Cav1.1-Cav1.4），Cav2（Cav2.1-Cav2.3）和Cav3（Cav3.1-Cav3.3）【5】。Cav1通道，也称为L-型Cav或结合二氢吡啶（dihydropyridine）受体的DHPRs，包含多个亚基，包括成孔α1核心亚基，辅助亚基α2δ，β和γ。Cav通道的α1亚基包含2,000个氨基酸残基，折叠为4个同源重复序列I-V，每个重复包含六个跨膜区段S1-S6，形成经典的电压控制离子通道（voltagegated ion channel，VGIC）。每个重复中的S1-S4形成外围电压感应域（voltage sensing domain，VSD）; 中心离子传导孔区域主要由S5和S6与选择性过滤器（SF）组成。

由于生理功能的重要性，Cav通道的异常调节或功能障碍与多种神经、心血管、肌肉和精神疾病相关【6】。因此，Cav通道也是重要的药物研究靶标。目前市场上有三种主要类型的L型Ca2+通道拮抗剂应用于临床，分别是二氢吡啶（DHP），苯并噻氮（benzothiazepines，BTZ）和苯烷基胺（phenylalkylamines，PAA）【7】。其中，DHP被广泛用于治疗高血压、心绞痛、早产等。作为BTZ和PAA的原型药物，diltiazem和verapamil广泛用于血管舒张、心绞痛治疗、高血压，以及某些心律失常和心动过速等。DHP拮抗剂主要通过变构效应起作用。拮抗剂有利于失活状态，而激动剂则导致L型Cav通道的长时间开放【8】。但有趣的是，一些与DHP拮抗剂相似的化合物对L型Cav通道却表现出激动剂的作用，如(S)-(–)-Bay K 8644（图1）。

图1. 具有代表性的DHP拮抗剂（A）和激动剂（B）的化学结构

此前，有课题组解析了与几种DHP拮抗剂和verapamil结合、细菌来源的CavAb晶体结构【9】。CavAb为同源四聚体结构，与真核单链Cav通道的亲缘关系相距甚远。尽管前人有很多对于此类激动剂和拮抗剂的机制做了研究，但是精确识别这些化合物的结构基础仍有待阐明。因此，解析与配体结合的Cav通道结构对于揭示DHP拮抗剂和激动剂的不同作用模式的分子机制研究是必需的。

在本实验室此前的基础上【2,3】，通过使用cryo-EM技术，颜宁组解析了rCav1.1与DHP拮抗剂nifedipine（N）和激动剂Bay K 8644（B）结合的复合物结构，总分辨率分别为2.9 Å和2.8 Å （图2）；rCav1.1与另外两种代表性BTZ和PAA原型药物，diltiazem（D）和verapamil（V）结合的复合物结构，总分辨率分别为3.0 Å和2.7 Å （图2）。

图2. 结合不同小分子的兔源Cav1.1结构分析。A. 分别结合nifedipine (N), Bay K 8644 (B), diltiazem (D), and verapamil (V)的Cav1.1 Cryo-EM Fourier shell correlation (FSC)曲线。 B. rCav1.1-N. Cryo-EM密度图。 C. 2.9 Å的rCav1.1-N Cryo-EM结构。

作者发现，结合了配体后，rCav1.1的结构会发生一定的构象改变。而对于以上的四种配体，结构上都有精确的识别机制。这些高分辨率结构的解析确信了BTZ和PAA药物是rCav1.1的核孔阻遏物，解释了两者的抑制效应。由于DHP小分子类似物既有拮抗剂效应，又有激动剂的效应，因此还需要更多结合这些小分子的不同状态的结构，才能完整的阐述相关的分子机制。总的来说，这些结构进一步在原子水平阐述了rCav1.1的分子基础，为临床研究、新药开发等提供了重要的参考价值。

这是颜宁课题组近几年来在离子通道蛋白研究中的又一重要突破。除了钙离子通道外，颜宁课题组还在钠离子通道、钠离子通道与配体等研究中取得过杰出的研究成果【10-13】（Science | 颜宁等揭示动物毒素调控Nav通道的详细结构机制——廖军点评；Science | 颜宁组解析人源电压门控钠离子通道蛋白Nav1.4-β1复合物结构）。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.043

参考文献

1. Yan, Z. et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature 517, 50 (2015).

2. Wu, J. et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1. 1 complex. Science 350, aad2395 (2015).

3. Wu, J. et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca v 1.1 at 3.6 Å resolution. Nature 537, 191 (2016).

4. Peng, W. et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science 354, aah5324 (2016).

5. Ertel, E. A. et al. Nomenclature of voltage-gated calcium channels. Neuron 25, 533-535 (2000).

6. Zamponi, G. W., Striessnig, J., Koschak, A. & Dolphin, A. C. The physiology, pathology, and pharmacology of voltage-gated calcium channels and their future therapeutic potential. Pharmacological reviews 67, 821-870 (2015).

7. Zamponi, G. W. Targeting voltage-gated calcium channels in neurological and psychiatric diseases. Nature reviews Drug discovery 15, 19 (2016).

8. Affolter, H. & Coronado, R. Agonists Bay-K8644 and CGP-28392 open calcium channels reconstituted from skeletal muscle transverse tubules. Biophysical journal 48, 341-347 (1985).

9. Tang, L. et al. Structural basis for inhibition of a voltage-gated Ca 2+ channel by Ca 2+ antagonist drugs. Nature 537, 117 (2016).

10. Pan, X. et al. Structure of the human voltage-gated sodium channel Nav1. 4 in complex with β1. Science 362, eaau2486 (2018).

11. Shen, H. et al. Structural basis for the modulation of voltage-gated sodium channels by animal toxins. Science 362, eaau2596 (2018).

12. Shen, H. et al. Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution. Science 355, eaal4326 (2017).

13. Zhang, X. et al. Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel. Nature 486, 130 (2012).

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