专家点评 | 张毅实验室神经生物学领域的开山之作，附论文背后的故事

编者按

说起哈佛大学张毅教授的课题组，很多人第一反应是他过去发了很多CNS，在表观遗传领域多个研究方向曾做出过杰出的贡献。此外，近期因为克隆猴的成功，张毅研究组2014年的关于体细胞核移植障碍的Cell也大火了一把。也许很多人可能习惯张毅课题组每年都有不俗的CNS发表，所以如果发的是子刊，可能就不会有那么多人在意了。最近这一个月，张毅课题组先后在Nature Genetics、Nature Comnunications、Nature Cell Biology上发表了三篇研究论文，Nature Genetics的论文有点拨乱反正的意味（专家点评Nature Genetics | 张毅团队证明体内DUX并非小鼠胚胎基因组激活的关键因子），虽是否定另外三篇Nature Genetics的工作，但是正如汪阳明老师点评时说的那样，“感谢这个工作以正视听，在受精卵基因组激活研究领域，‘革命尚未成功，同志仍需努力’”，另外一篇NCB的文章是讲胚胎干细胞从多能性到全能型的障碍，这个工作即将在线，BioArt届时将专题报道。可能最不受重视的是这篇NC文章，第一反应因为是对NC杂志的偏见，毕竟国内去年以通讯或第一单位在该杂志上发表的生命科学领域的论文超过300篇，第二反应也许因为讲的多巴胺神经元的故事，被认为只是一个边角料的工作加以选择性忽视。实际情况是，这篇工作倾注了张毅课题组大量的心血，该工作前后历时5年多，投稿过程异常曲折，最后到NC。这篇文章虽是张毅课题组的转型之作（目前张毅实验室有超过半数的博后是神经科学背景），但是研究成果并不一般，有许多亮点，关于成果到底如何读者可以去评判，但是值得一提的是论文第一作者、张毅组的博后Luis M. Tuesta仅凭借这篇文章在迈阿密大学（University of Miami）拿到了教职开始独立做PI，我想单凭这一点已经能说明一些问题。关于这篇文章的背后的一些故事，BioArt也有幸邀请到了见证整个工作从开始到发表的陆发隆博士（张毅研究组过去的博后，现为中科院遗传发育所研究员）详述论文背后的故事。此外，BioArt还特别邀请了浙江大学神经科学研究中心的陈家东研究员对相关工作进行了专业点评，以飨读者！

撰文 | 王小果

点评 | 陈家东（浙江大学神经科学研究所）

责编 | 兮

尽管中脑神经元数量只占不到1%的大脑神经元，但是它却是多巴胺神经元的主要来源【1】。多巴胺（dopamine，DA）是儿茶酚胺类神经递质，可以与脑内广泛表达的多巴胺能受体结合，在中枢神经系统中有着极其重要的作用，多巴胺神经元可调节和控制许多重要的行为过程，其中包括运动、认知、奖赏、情感、学习记忆和神经内分泌的调节等。一直以来认为中脑多巴胺主要由3个DA神经元核群合成：腹侧被盖区（VTA）、黑质致密区（SNc）、红核后区。目前对于多巴胺信号在生理状态和疾病状态下的作用研究甚多，但是对于染色质结构是如何让调控中脑多巴胺神经元上的基因表达知之甚少。

近日，美国波士顿儿童医院遗传与儿科系讲席教授、哈佛大学医学院遗传学系Fred Rosen 讲席教授、表观遗传学领域最出色的科学家之一、霍华德休斯医学研究所研究员张毅教授课题组在Nature Communications上发表了In vivo nuclear capture and molecular profiling identifies Gmeb1 as a transcriptional regulator essential for dopamine neuron function【2】的文章，开发了一个用于特异性分离高纯度中脑腹侧被盖区多巴胺神经元细胞核的新方法，收集少量特异性的细胞核进行染色质可接近性(chromatin accessibility），最终鉴定了具体功能未知的关键调控因子Gmeb1可以调控中脑多巴胺神经元的基因表达，并能够维持小鼠的多种运动功能。从方法学和功能研究上都具有十分重要的意义！

为特异性标记中脑神经元，研究人员构建了病毒AAV-DIO-KASH-HA，注射到多巴胺转运体-cre小鼠（dat-cre），以此实现KASH-HA特异性表达在中脑神经元上。免疫荧光实验发现酪氨酸羟化酶（TH，一种儿茶酚胺合成的限速酶，可作为中脑神经元的标记物）和HA共标达到87.2%，此外，多巴胺和HA共标达到97.3%，这些结果表明KASH-HA特异性表达在中脑神经元上（图1）。

图1 KASH-HA标记用于转录组学分析

利用荧光激活细胞核分选技术将HA阳性细胞和HA阴性细胞区分开以后，再结合RNA测序技术发现HA阳性细胞和HA阴性细胞共存在13727个基因表达，其中在HA阳性细胞上存在394个基因富集表达（表达量至少是HA阴性细胞的4倍以上）。尽管这些基因富集表达在中脑多巴胺神经元上，但是它们也会在其他神经元类型上表达。研究人员进一步和其他三种类型的神经元（表达血管活性肠肽的神经元、兴奋性皮层神经元、表达小清蛋白的神经元）进行比较后发现107个基因在中脑多巴胺神经元上富集，将其命名为中脑多巴胺富集基因（mDA-enriched genes）。

接下来，研究人员进一步想知道激活这些富集基因的转录调控因子，他们构建了中脑神经元的DNaseI超敏感位点（调节性DNA序列的标记物）图谱，发现了28084个DNaseI超敏感位点，超过40%的位点位于基因启动子序列内，其中2374个位点富集在中脑多巴胺神经元上（染色质开放区域只在中脑神经元上）。很意外的是，这些富集在中脑神经元上DNaseI超敏感位点并不在启动子序列内。进一步发现存在11个转录因子参与调控中脑富集基因，其中糖皮质激素调节因子结合蛋白-1（Gmeb1，glucocorticoid modulatory element binding protein-1）最具潜力的候选因子，它可以调控多巴胺合成、多巴胺囊泡组装、多巴胺再摄取、自调节等过程（图2）。

图2调控中脑富集基因的转录因子

以往研究发现Gmeb1可以促进对低糖皮质激素的敏感性，也可以在氧化应激过程中起到神经元保护作用【3】。如果敲除中脑Gmeb1会产生什么功能影响？研究人员向中脑注射Gmeb1沉默病毒后发现该脑区存在79个表达上调的基因，99个表达下调的基因（包括9个中脑富集基因），不会造成该脑区神经元死亡，但是会降低多巴胺和酪氨酸羟化酶的表达（图3）。

图3 敲低中脑Gmeb1后引起酪氨酸羟化酶Th的表达发生变化

由于酪氨酸羟化酶减少后多巴胺合成降低，多巴胺信号的紊乱会进一步影响运动功能。因此，研究人员向黑质致密部注射Gmeb1沉默病毒后利用细胞吸附式电记录实验发现敲低Gmeb1不会影响该脑区神经元的兴奋性、放电频率，但是会影响其运动功能，具体表现为在旋转实验中（评价小鼠耐受疲劳，平衡控制、运动协调能力）小鼠呆在轮转棒上的时间减少，说明运动协调能力降低；游泳实验中小鼠的游泳运动能力降低。

总的来说，本文开发出一种基于病毒的标记中脑多巴胺神经元的细胞核捕获技术，利用该技术首次发现转录因子Gmeb1调控中脑多巴胺神经元的基因表达，并参与很重要的运动功能，因为从分子水平及表型两方面来看，抑制Gmeb1 表达跟Parkinson Disease 很相似，这一工作为研究PD提供了很好的小鼠模型。由于开发的这项新技术能够解决神经生物学领域细胞特异性分离的问题，因此今后对于神经退行性疾病相关的特异性转录调控研究具有重要的意义。

专家点评

陈家东（浙江大学医学院神经科学研究所）

哈佛医学院的张毅教授在表观遗传、干细胞和早期胚胎发育等领域做出了一系列杰出的工作，该实验室发现的体细胞核移植重编程的表观遗传障碍以及利用Kdm4d对体细胞核移植技术的改进，为神经领域非常关注的克隆猴工作的实现奠定了基础。本篇文章是张毅实验室进入神经生物学领域的开山之作。多巴胺是脑内重要的奖赏系统，作者建立了一个全新的分析方法，通过选择性标记中脑腹侧被盖区(Ventral tegmental area, VTA)多巴胺释放神经元并进行细胞核纯化，并对收集到的少量细胞核进行染色质可及性分析，发现很多新的多巴胺能细胞特异的表观修饰因子，其中包括功能未知的Gmeb1（glucocorticoid modulatory element binding protein-1），作者发现Gmeb1调控多巴胺合成关键的TH，dat等gene非常关键，并且选择性在脑内TH阳性细胞中敲除Gmeb1之后，小鼠出现了多种运动功能障碍，如爬竿、转棒、强迫游泳等。

可以预见，随着本文的少量细胞核DNase-seq技术的建立和单细胞核ATAC-seq技术的不断完善（UCSD Ren Bin, PMID:  29434377），神经系统的细胞异质性以及细胞亚类特异的调控因子（TFs）将被不断发掘，这一系列发现将有助于深入理解脑高级功能如奖赏学习与动机行为的调控，以及神经退行性疾病和精神疾病发生的全新分子机制。

附：论文背后的故事

陆发隆（中科院遗传发育所）

Luis 2013年年底加入Yi实验室，他之前Ph.D.期间主要通过行为学实验研究药物成瘾，包括可卡因自我注射小鼠模型。他来的一个重要原因是他和Yi都想把药物成瘾模型和细胞类型特异转录组/表观基因组分析结合起来。

在2014年上半年的时候讨论研究可卡因起作用重要的VTA区域中多巴胺神经元对可卡因的响应(中脑腹侧被盖区,简写为VTA， VTA是中脑皮质边缘多巴胺系统和其他多巴胺途径的多巴胺能细胞体的起源，与成瘾高度相关）。此前领域内研究都是将VTA整块脑区切块来分析。但是其中混着各种细胞类型，难以搞明白多巴胺神经元的响应。因此在此研究中最重要的是特异分离VTA中多巴胺神经元用于后续分析。到了5月份左右的时候决定标记细胞核用于分离，最初的想法是一个复杂的系统。一方面表达HA-VHH-KASH，VHH是一段识别GFP的nanobody序列。起初的想法是通过在DAT:CRE小鼠（注射CRE依赖的病毒或者与loxp小鼠杂交后可特异性标记中脑多巴胺神经元）里注射CRE依赖的HA-VHH-KASH病毒，同时表达GFP。通过KASH结构域将HA-VHH-KASH锚定在细胞核膜上，然后VHH将GFP抓到核膜表面，通过GFP-trap将细胞核分选出来。

CRE依赖的HA-VHH-KASH表达质粒是我构建的。我查了下质粒构建的记录。2014/6/18日，从Rockfefeller拿到NBL10质粒与图谱用做backbone。从MIT拿到KASH domain质粒，然后构建了该质粒，并包装AAV病毒，用于DAT：CRE小鼠的VTA脑区注射，通过切片免疫染色发现确实HA-VHH-KASH在VTA区域多巴胺神经元特异表达。

但是后续实验初期并不顺利。首先GFP-trap拿到的细胞量不多，且纯度很低。于是我们采取Sort HA-VHH-KASH GFP细胞核的策略，但发现信号很弱，很难sort到高纯度的多巴胺神经元细胞核。再后来采用提取细胞核之后快速进行HA抗体免疫染色，再进行流式细胞仪分选。这样才成功得到高纯度VTA区域多巴胺神经元细胞核。也就是这篇发表文章中用的方法。

有了高纯度的细胞核之后转录组和表观基因组的分析对我们来说就很容易了。这篇文章里主要展示的是liDNase-seq的结果，因为我们正好在胚胎研究中开发了该方法，就很快地应用到了神经科学的研究中。同时其实还做了DNA甲基化的分析，以及不同可卡因处理对表观基因组的改变。在本篇发表的文章中只展示了通过liDNase-seq找到对VTA区域多巴胺神经元功能调控有重要作用的Gmeb1转录因子，并对其功能进行了进一步的研究。liDNase-seq在2015年就已经完成，后续是对转录因子进行敲降验证其分子功能与对行为的影响进行进一步研究。

本篇文章第一次投稿其实是在2017年11月，之后辗转了多个杂志。到现在发出来经过了19个月，可以看到神经科学圈外人想进入这个领域碰到了多少阻力。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-019-10267-0

编者记：笔者在同张毅教授交流的过程中能够感受到他对这个工作的重视，最近一两年他回国交流的次数不少，因为克隆猴的影响，他的报告总会提一下提高核移植重编程效率的工作，但是几乎每次做报告重点要讲的都是这篇NC的工作，可见这个工作在他心里的分量不一般。尽管这个NC论文的一作在五六年的博后生涯就发表了这一项工作，但是也依然能在美国大学拿到教职。笔者不禁要问，什么样的工作是好工作？在美国找教职更看重的是什么？不跟热点转型这么难还要不要继续？抛开杂志因素谈工作有多难？

笔者经常会听到有人说，XX工作这么一般居然发了CNS，XX的文章被NC拒了发到了CSC，XX的工作被STM拒了发了Cell，XX工作这么好怎么只发了CR，说实话这些事情太正常不过，但是对于专业的同行来说，最重要的是看工作本身而不是光顾着杂志本身和影响因子，不然幼儿园大班的小朋友也能做出大差不差的判断。随着国内在高水平期刊上的文章越来越多，同行们肯定会逐步注重工作的本身，相信国内同行对杂志和影响因子会逐步淡化的，更多回归科学的本身。

参考文献

1. Nelson, E. L., Liang, C. L., Sinton, C. M. & German, D. C. Midbrain dopaminergic neurons in the mouse: computer-assisted mapping. J. Comp.Neurol. 369, 361–371 (1996)

2. In vivo nuclear capture and molecular profiling identifies Gmeb1 as a transcriptional regulator essential for dopamine neuron function，Nature Communications,https://doi.org/10.1038/s41467-019-10267-0

3. Kakinuma, K., Sorimachi, H., Labeit, S. & Gregorio, C. C. Muscle-specific RING finger-1 interacts with titin to regulate sarcomeric Mline and thick filament structure and may have nuclear functions via itsinteraction with glucocorticoid modulatory element binding protein-1. J. Cell Biol. 157, 125–136 (2002)

制版人：半夏

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