专家点评 | 3篇Nature1篇Nat Immuno揭示调控耗竭CD8+T细胞的关键因子

撰文 | 小飞飞

点评 | 郭心怡、董晨（清华大学）

责编 | 兮

急性感染中，CD8+初始T细胞在接受抗原刺激之后，可分化为CD8+效应T细胞（effector CD8+ T cells, TEFF）。如果抗原被清除，一部分的TEFF会持续存在，形成长寿的可以自我更新的记忆T细胞（memory CD8+ T cells, TMEM），以对再次感染产生快速的免疫反应。相反，在慢性感染或者肿瘤中，抗原持续存在，初始T细胞的分化将会变得不一样，T细胞会分化为耗竭T细胞（exhausted CD8+ T cells, TEX）【1】。TEX可限制部分病原体感染或者肿瘤免疫反应，来限制免疫介导的病理损伤，但这种限制性功能的结果往往是疾病的持续进展或恶化【2】。在小鼠和人的许多慢性感染和肿瘤中，T细胞耗竭是一个比较普遍的特征。TEX也成为肿瘤免疫检查点抑制治疗中的一个主要靶标。

TEX的特征包括，炎症细胞因子（IL-2,TNF,IFNγ）产生减少，表达较高水平的抑制性受体（PD-1,LAG3,TIGIT等），代谢的改变，受损的扩增和存活能力等【1】。同时TEX也表现出不同的转录水平的变化，对几种关键转录因子的使用都和效应T细胞有明显区别。此外，文献报道与TEFF和TMEM相比，TEX有大约6000个不同的染色质开放区域【3】。可见，TEX不仅仅是TEFF或者是TMEM的一种状态，而是一类不同的细胞亚群。但是，起始TEX分化发育以及其表观遗传水平和转录水平变化的具体机制还有待研究。

胸腺细胞选择相关HMG盒蛋白（Thymocyte selection-associated HMG box protein, TOX）是细胞核DNA结合蛋白，也是HMG盒蛋白超家族（high-motility group box superfamily）成员之一，以结构依赖而非序列依赖的方式与核DNA结合【4】。已有文献可知，TOX对胸腺CD4+T细胞发育，NK细胞发育以及固有淋巴细胞发育都有重要作用【5】。但是其在慢性感染或肿瘤中耗竭CD8+T细胞中的作用还未知。

2019年6月17日，Nature以及Nature Immunology杂志同时发表四篇相关文章，讲述了TOX对CD8+耗竭T细胞分化发育的重要作用及其分子机制。BioArt现整理如下，并特别邀请了从事相关工作的权威专家、清华大学免疫所董晨教授进行了点评。

第一篇是来自Department of Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, Philadelphia, PA, USA的E. John Wherry团队在Nature上发表的题为TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion的Article形式长文文章，发现慢性感染中，TOX对TEX的分化形成至关重要，可以从转录水平和表观遗传水平上启动并主导TEX的分化发育，并对其中的具体机制做了研究。

首先研究人员利用LCMV急性感染（Armstrong; Arm）和慢性感染模型（Clone 13; Cl-13），分析感染以后病毒特异性CD8+T细胞（TEFF，TMEM和TEX）转录水平数据的差异，发现感染6天以后，TEFF，TMEM和TEX基因表达有较大的差异，其中Tox是差异表达最大的基因。同时ATAC-Seq测序表明，与TEFF相比，TEX中Tox 基因座染色质开放性(chromatin accessibility)增加。这些数据表明TOX或可在TEX分化中起重要调控作用。

随后研究人员发现，Cl-13感染之后4天开始，TOX蛋白表达量就明显增加，感染后5天80% LCMV特异性P14 CD8+ T 细胞有较高水平TOX表达，且这种高表达可持续200天以上。与之相反的是，在急性感染中，尽管TOX在TEFF反应起始有表达，感染5-6天后达到高峰，但只有低于25%TEFF有TOX表达，且表达量相对较低，感染8-15天之后，表达量降低到基线水平。在Cl-13感染中TOX表达与T细胞耗竭相关转录因子TCF1和Eomes表达正相关，同时TOX+细胞也高表达抑制性受体PD-1, TIGIT, LAG3, 和 CD160等。由此可见，高水平持续性TOX的表达和T细胞耗竭密切相关。

为进一步研究TOX在TEX中作用，研究人员利用TOX Flox/Flox CD4Cre P14小鼠在P14T细胞中敲除TOX。慢性感染中，与WT P14T细胞的持续存在相比，TOX敲除P14T细胞在起始阶段可产生反应，但随后数量大幅减少，且不能持续到感染后15天。但在急性Arm LCMV感染中，TOX敲除P14T细胞可以产生正常的反应，发育成为TEFF和TMEM。因此TOX敲除的初始T细胞并不是影响CD8+T效应和记忆细胞的分化，而是导致TEX特异性的缺失。慢性感染中，TOX敲除细胞表达更低水平的PD-1, CD160, LAG3, 和TIGIT，相反2B4和TIM3表达增高，这也与之前文献报道在Cl-13感染中，PD-1和TIM3表达呈负相关相一致。TOX缺失也提高了T细胞的功能，研究人员发现与WT相比，TOX缺失肿瘤特异性T细胞对肿瘤具有更强的抗肿瘤能力。TEX的产生和稳定需要TCF1，T-bet和Eomes不同转录因子在各个发育阶段的作用。TOX的缺失使Eomes表达减少，但不影响T-bet的表达。慢性感染中，TOX缺失使得TEX中TCF1表达几乎完全消失。但在急性感染中，TOX缺失不影响TCF1在初始T细胞和TMEM中的表达。对Cl-13慢性感染第8天WT和TOX敲除P14T细胞进行转录水平测序分析发现，TOX的缺失，会上调许多TEFF样基因（Klrg1, Gzma, Gzmb, Cx3cr1, Zeb2 和 Prf1等）而下调Pdcd1 和Cd160 以及其他和TEX祖细胞相关的基因如Myb, Il7r, Cxcr5, Slamf6, Lef1, 和 Tcf7等。总之这些数据表明，慢性感染中，TOX通过促进耗竭相关基因表达抑制效应细胞相关基因的表达从而促进TEX的产生。

随后研究团队通过体外实验发现TOX在CD8+T细胞上的表达主要受到钙调神经磷酸酶（calcineurin）介导的信号调控，而calcineurin信号通路主要由NFAT蛋白家族的介导，Nfatc1 (NFAT2)在TEX中的表达和在TEFF和TMEM中的不同，因此研究人员关注NFAT2。NFAT2敲除P14T细胞在Cl-13慢性感染中，不能表达TOX，与TOX敲除P14T细胞表型类似，NFAT2缺失T细胞不能产生TEX前体细胞，相反产生KLRG1表达升高，PD-1和TCF1表达降低的TEFF样细胞。Cl-13慢性感染后3-7天，使用calcineurin抑制剂FK506也可产生NFAT2敲除类似结果。在NFAT2敲除P14T细胞中利用逆转录病毒过表达TOX可以恢复PD-1和其他抑制性受体的表达，增加Eomes和TCF-1的表达。可见，此感染阶段，calcineurin和NFAT2对于TOX的诱导是必须的，且TOX是calcineurin和NFAT2重要下游分子。但慢性感染25-29天之后，使用FK506抑制NFAT2信号，不会影响TOX的表达以及下游PD-1和Eomes的表达。这表明，尽管TOX的起始诱导表达需要NFAT2，但在起始表达建立之后，TOX的表达和TOX依赖的TEX分化却不依赖于calcineurin信号。

之后，研究人员检测TOX是否是诱导T细胞耗竭的充分条件，将逆转录病毒过表达TOX的P14T细胞输入到LCMV Arm感染小鼠中，流式检测以及RNA-Seq测序都表明TOX过表达使得T细胞向TEX方向分化而阻止其向TEFF和TMEM发育。

随后研究人员分析TOX对TEX表观遗传水平的影响。对LCMV Cl-13感染第8天P14T细胞ATAC-Seq发现TOX的缺失可以引起基因组约4000个区域染色质开放性的改变，增加了TEFF相关基因位点的染色质开放性而降低了TEX相关基因的染色质开放性。为进一步探究TOX影响TEX表观遗传的机制，研究人员利用免疫共沉淀和质谱分析寻找TOX的结合蛋白。分析发现参与到组蛋白H4和H3乙酰化修饰的HBO1复合物是TOX的主要结合蛋白，同时也发现TOX和其他多种染色质重塑蛋白可相互作用。

总之，本研究发现TOX是TEX分化发育的主要调控分子，可以从转录水平和表观遗传学水平上启动并主导TEX的分化发育，且发现了TEX中TOX上下游调控的具体通路。

第二篇文章是来自德国Technical University of Munich的Dietmar Zehn及其合作者Robert Thimme， Benjamin Youngblood团队在Nature上发表的题为TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection的Letter形式文章。

与第一篇文章相似，这篇文章在小鼠和人中发现TOX对于耗竭T细胞的产生具有重要作用。该研究团队也利用LCMV急性和慢性感染小鼠模型发现，与TEFF相比，TOX特异性在TEX中高表达，且其表达和PD-1呈正相关。在人慢性丙肝病毒（HCV）感染患者中，也发现了TOX表达的增高并和PD-1表达相关。为进一步探究TOX和TEX的关系，研究人员在T细胞中条件性敲除Tox 5号外显子（Tox∆），移除了Tox核转运序列和2/3的DNA结合结构域。

在LCMV慢性感染中，与WT相比，Tox∆ T细胞有更低的PD-1表达和更高的的KLRG1表达。对WT 和Tox∆ LCMV-特异性 CD8+ T细胞进行Next generation sequencing (NGS)测序，结果也表明TOX调控耗竭相关基因的转录表达。通过体内LCMV感染实验，研究人员发现TOX的表达可以减缓效应T细胞引起的病理损伤。研究团队还发现Tox∆ P14T细胞在慢性感染中会过早死亡，但在急性感染或者混合感染中，Tox∆ P14T细胞可产生正常的免疫反应。表观遗传学水平上，研究团队也发现TOX可以调控耗竭相关程序，从而使细胞处于功能障碍状态。总之，本文也证明了慢性感染过程中，TOX对于耗竭T细胞的产生分化都具有重要调控作用。

第三篇文章是来自Memorial Sloan Kettering Cancer Center 和Weill Cornell Graduate School of Medical Sciences的Mary Philip和Andrea Schietinger团队在Nature上发表的题为TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation的Letter形式文章，阐述了TOX在调控肿瘤特异性T细胞（tumor-specific T cell ,TST）功能障碍方面的重要作用。

本文发现，TOX在功能障碍的肿瘤特异性CD8+T细胞中高表达，且TOX的表达需要慢性的TCR刺激和NFAT的激活。在体外效应T细胞中过表达TOX可在转录水平上诱导出耗竭相关变化。相反，TST中TOX的缺失，则会使耗竭相关转录变化消失，也不会上调抑制性受体的表达。尽管TOX缺失的TST有正常的“非耗竭”免疫表型，但他们仍然处于功能障碍状态，这表明在功能障碍TST中，对抑制性受体的调控和效应功能的缺失是不相关联的。此外，在肿瘤中，TOX缺失CD8T细胞不能够正常分化发育，但在急性感染中，其可以正常产生免疫反应分化为效应细胞和记忆细胞。总之本文表明，在慢性抗原刺激下（肿瘤或慢性感染中）TOX是特异性调控功能障碍T细胞分化的重要分子。

第四篇文章是来自National Institutes of Health（NIH）的Tuoqi Wu，Pamela L. Schwartzberg以及John J. O’Shea团队在Nature Immunology上发表的题为Single-cell RNA-seq reveals TOX as a key regulator of CD8+ T cell persistence in chronic infection的文章。

本文利用单细胞测序技术，检测急性和慢性LCMV感染中病毒特异性CD8+T细胞群的异质性。测序结果表明，急慢性感染中CD8+T细胞转录水平差异在CD8+T细胞反应峰之前就已经出现。尽管两亚群细胞都表达Tcf7相关基因模组，但慢性感染中的祖细胞样CD8+T细胞富集表达Tox相关基因模组，从而和记忆前体细胞有较大差异。表观遗传学检测表明，慢性感染中，祖细胞样CD8+T细胞也具有独特的表观遗传学特征，Tox相关基因具有更高的表观遗传活性。此外，LCMV慢性感染中，TOX可以维持病毒特异性CD8+T细胞的长期存活，相反，TOX的缺失会导致祖细胞样CD8+T细胞亚群的缺失影响抗病毒CD8+T细胞的存活。总之，本文通过单细胞测序和表观遗传学检测表明，慢性病毒感染中，祖细胞样CD8+T细胞受到和记忆前体细胞不同的转录水平和表观遗传水平的调控，其中TOX在其中起着重要作用。

以上研究系统而又详细地阐述了慢性感染以及肿瘤过程中，TOX对耗竭CD8+T细胞分化发育的调控及其具体分子机制。这些结果也表明：第一，TOX的表达以及其控制的分子事件可以作为一种标志，能够帮助我们更准确地检测评估TEX；第二，这一系列研究发现了调控耗竭T细胞的关键分子TOX，对TOX调控也可改变TEX细胞表型，或可用于未来肿瘤免疫治疗；第三，这些数据也表明TEX是和TEFF与TMEM不同的细胞亚群，并为这种分群分化提供了相应的分子机制支持。

专家点评

郭心怡、董晨（清华大学医学院、清华大学免疫研究所）

T细胞耗竭是T细胞处于抗原长期刺激下出现细胞因子逐渐丧失、高表达抑制性受体、代谢改变、增殖潜力和生存能力下降等特征的过程。耗竭T细胞是针对癌症病人的免疫检查点抑制剂治疗的主要靶细胞群。2016年底，Nicholas Haining、Nir Yosef两课题组合作，与E. John Wherry课题组分别报道了耗竭T细胞区别于记忆T细胞和效应T细胞的表观遗传组特征，指出表观遗传的改变对耗竭T细胞状态的维持具有重要作用【6,7】。然而在T细胞耗竭过程中参与转录组及表观基因组变化的调控机制并不完全清楚。

2019年6月17日Nature在线发表的三篇文章和Nature Immunology在线发表的一篇文章共同阐述了TOX基因作为一个关键调控因子如何参与在慢性病毒感染和癌症中的T细胞耗竭过程。这四项研究一致发现，TOX的高表达与多个抑制性受体的高表达、TCF1的低表达相关；TOX的表达受NFAT正向调控。TOX表达即可诱导CD8+ T细胞呈现出耗竭T细胞的主要特征，且TOX的表达在LCMV、HCV或在一个自发性肝癌模型的抗原特异耗竭T细胞形成其特殊的转录组及表观遗传组特征中起到关键的调控作用，而与记忆T细胞或效应T细胞的形成过程无关，从而进一步暗示了耗竭T细胞是一类特殊的细胞，而非另两者的一个特殊激活状态。同时该四项研究发现，TOX的表达对于慢性感染或癌症模型中的抗原特异CD8+ 耗竭T细胞的存活是必需的。敲除TOX后的T细胞虽然PD1等抑制性受体表达下降、细胞因子增多，呈现出较强的效应功能，然而这些T细胞的数量会在后期大量下降，尤其会导致TCF1+的耗竭前体T细胞亚群缺失。E. John Wherry课题组发现这些前体细胞的缺失是由于TCF1和Eomes的转录调控过程失效导致的。因此，TOX对于T细胞正常功能的发挥以及耗竭T细胞的存活起到了关键作用；暗示当环境中的抗原无法被清除时，TOX调节了T细胞介导的病毒控制和免疫反应之间的平衡，防止了T细胞因过度激活而引起的细胞死亡。 

此外，Andrea Schietinger课题组与Mary Philip课题组合作发现，即使体外重新刺激，TOX高表达的肿瘤特异T细胞也无法产生功能性细胞因子，暗示TOX相关的T细胞耗竭不可被逆转。他们的研究特别发现，在一个自发性肝癌模型的肿瘤特异T细胞中敲除TOX后，细胞虽未上调PD1、LAG3等调抑制性受体但仍处于失能状态，暗示在肿瘤特异T细胞失能过程中抑制性受体的表达与细胞效应功能的丧失并不紧密相关。

值得注意的是，TOX的表达既诱导抑制性受体的高表达，使T细胞进入失去功能的耗竭状态，同时又对维持耗竭T细胞在慢性感染或肿瘤中的存活至关重要，因此由TOX调控的T细胞耗竭可能是T细胞处于免疫抑制环境中的一种适应机制。

已有研究表明，耗竭T细胞的特殊转录组、表观基因组特征会使其所处的失能状态无法被逆转，从而无法对免疫检查点抑制剂药物产生持续的免疫应答【6】。这四篇文章揭示的TOX相关调控机制可能给临床上不响应现有免疫检查点抑制剂药物病人的治疗带来新的思路，也为过继细胞转移疗法中的T细胞耗竭以及细胞活性维持问题提供了一定的指导意义。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1324-y；

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1326-9；

https://www.nature.com/articles/s41586-019-1325-x；

https://www.nature.com/articles/s41590-019-0403-4

参考文献

1. Wherry, E.J. and M. Kurachi, Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol, 2015. 15(8): p. 486-99.

2. Barber, D.L., et al., Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature, 2006. 439(7077): p. 682-7.

3. Doering, T.A., et al., Network analysis reveals centrally connected genes and pathways involved in CD8+  T cell exhaustion versus memory. Immunity, 2012. 37(6): p. 1130-44.

4. O'Flaherty, E. and J. Kaye, TOX defines a conserved subfamily of HMG-box proteins. BMC Genomics, 2003. 4(1): p. 13.

5. Aliahmad, P., A. Seksenyan and J. Kaye, The many roles of TOX in the immune system. Curr Opin Immunol, 2012. 24(2): p. 173-7.

6. Pauken, K.E., Sammons, M.A., Odorizzi, P.M., Manne, S., Godec, J., Khan, O., Drake, A.M., Chen, Z., Sen, D.R., Kurachi, M., et al. (2016). Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160–1165.

7. Sen, D.R., Kaminski, J., Barnitz, R.A., Kurachi, M., Gerdemann, U., Yates, K.B., Tsao, H.-W., Godec, J., LaFleur, M.W., Brown, F.D., et al. (2016). The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165–1169.

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