专家点评Nature | 陈凯博士等报道首个脊索动物完整胚胎发育单细胞转录谱系
点评 | 董波 （中国海洋大学）
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解析细胞命运决定过程的转录动态是发育生物学的核心问题之一。然而在以调控发育（regulatory development）为主的多数动物模型中，细胞种类的多样性和发育过程的复杂性让这一问题很难在体内有效回答。与之相反，包括线虫和海鞘在内的镶嵌发育（mosaic development）动物因胚胎发育个体差异极小，细胞谱系清楚，非常适合研究细胞命运决定过程中的转录调控。尤其是海鞘，作为脊椎动物的近亲，在探索脊索动物细胞命运决定保守机制和进化发育上有着极其重要的地位。
海鞘生命之河。图：杜征
2019年7月11日，普林斯顿大学陈凯博士（已于2018年11月加入昆明理工大学灵长类转化医学研究院，注1）和Mike Levine院士（hox基因的共同发现者）合作在Nature杂志以长文形式发表了题为Comprehensive single-cell transcriptome lineages of a proto-vertebrate的研究论文。他们所在的研究团队以玻璃海鞘为模型，绘制了首个涵盖从三胚层分化到孵化全过程的脊索动物胚胎发育单细胞转录图谱，并成功构建了包括神经系统在内全部组织类型的细胞分化谱系。在此基础上，研究团队能够有效地探索细胞命运决定过程中的基因调控网络，并对脊索和神经系统基因调控网络的细致分析，揭示了脊索在整个脊索动物门进化过程的中间态，并提出脊椎动物特有的端脑（telencephalon）可能的新进化机制。
利用这些高覆盖率的转录组数据，文章的共同第一作者曹晨博士构建了包含幼虫神经系统近40个亚型的各种主要组织类型的虚拟细胞谱系图和基因网络。这些细胞谱系可以追溯回原肠胚初始的110-细胞阶段，包括生殖系，未分化的内胚层组织，两个来源的脊索细胞（来自A谱系的初始脊索和B谱系的次级脊索），不同起源的肌肉谱系，在神经胚就开始命运决定的9类间充质细胞，以及由A谱系和a/b谱系构成的复杂神经系统。
海鞘（Ciona intestinalis）。图片引自：https://cn.depositphotos.com
作为无脊椎往脊椎过渡的进化节点动物，海鞘在了解脊索/脊椎动物新细胞类型的进化上有着重要的研究意义，包括脊索和各种新型神经细胞类型。通过对A和B谱系脊索细胞分化的转录谱分析，研究团队发现B谱系的脊索在原肠胚阶段表达一些肌肉发育的转录因子（Tbx6a/b/c/d）,随后表达许多肌肉相关的功能基因。进一步的报告基因验证发现有着Tbx6结合序列的Casq1/2和C9.405增强子能特异地让荧光蛋白在肌肉和次级脊索中表达。这些证据充分证明了海鞘的脊索在进化上介于以文昌鱼为代表的头索动物和脊椎动物之间，即A谱系的脊索具有脊椎动物的特征，而B谱系脊索有类似文昌鱼脊索的部分肌肉功能。
端脑是公认的脊椎动物的主要进化创新，为之后高等脊椎动物大脑皮层的进化提供基础。目前被广泛接受的假说是原始前脑的分区，形成间脑和端脑。通过对构建的玻璃海鞘所有前脑和相关细胞谱系的调控基因分析，研究团队发现主要的端脑发育转录因子在玻璃海鞘都有表达，但分别在两个结构上完全不同的区域。其中Six3/6, FoxJ1, Lhx2/9和Otp在前脑最前侧表达，而FoxG, Dlx和SP8则在神经基板来源的感受细胞表达。基于这些结果，研究团队提出端脑有可能是前脑在神经管闭合过程中进一步往末端延伸，将神经基板的调控网络整合形成。为了验证这一个假说，为了验证这一个假说，来自Stowers Institute的王伟博士加入这项研究，通过将连接着海鞘FoxG增强子的报告基因注射到非洲鳉鱼（N. furzeri）受精卵中（注2），利用非洲鳉鱼性成熟极快的特点快速建立了稳定的转基因系，他惊喜地发现这个在神经基板里特异表达的荧光蛋白在鳉鱼幼虫的端脑最末端表达。这一发现和提出的前脑和神经基板基因网络整合的假说相一致，为脊椎动物端脑的起源和进化提供了重要分子证据。
注1：本项工作的共同通讯作者陈凯博士已于2018年11月加入昆明理工大学灵长类转化医学研究院，并入选云南省“千人计划”。陈凯博士2005年毕业于兰州大学生命科学学院获得本科学位，之后在中科院昆明动物所季维智院士实验室进行硕士学习，2013年从美国斯托尔斯医学研究所取得发育生物学博士学位，2013-2018年在美国斯托尔斯医学研究所和美国普林斯顿大学从事博士后研究，先后师从美国科学艺术学院院士Conaway夫妇和美国科学院院士Mike Levine。长期从事早期胚胎发育的转录调控研究，发现合子基因组启动过程中核心启动子的差异性使用，首次运用单细胞测序揭示神经脊在脊索动物的进化来源，成功结合单细胞测序和发育生物学手段揭示多巴胺神经元终末分化保守的调控策略，作为主要参与人完成多项美国国立卫生研究院科研项目。以通讯作者/第一作者和主要作者在Nature、Cell、eLife、Cell Rep、Genes & Development、Genome Research等国际学术刊物上发表多篇论文。目前实验室正大力组建一流的团队，有先进的实验仪器和良好科研条件，科研经费充足，欢迎对发育生物学和转录调控感兴趣的硕、博研究生，科研助理，研究员，副教授等各层次人才与他联系。E-mail：chenk@lpbr.cn。
昆明理工大学灵长类转化医学研究院在季维智院士带领下，围绕灵长类发育与衰老、干细胞多能性和复杂疾病机制等科学问题，聚焦以基因治疗和干细胞治疗为基础的新的生物治疗方法，建立从基础到临床的系统研究体系，通过深入研究灵长类胚胎早期发育、基因编辑与复杂疾病机制和干细胞与再生医学，揭示灵长类重要生命过程的发生规律，阐明复杂疾病的致病机理，为发展新的生物治疗方法提供思路和科学依据。研究院自2015年成立以来，已在Cell、Cell Stem Cell等期刊发表多篇高水平论文，并活跃在灵长类生物医学研究的前沿领域，呈现出快速发展的态势。单位网址：www.lpbr.cn。
注2：在验证端脑演化中，研究团队用到了最近频频上NCS的新模式动物-非洲鳉鱼Nothobranchius furzeri。（是的，就是那个很短命的极有可能将在衰老研究上大放异彩的魔法鱼）。其实除了因长年累月适应非洲间歇湖的生态环境而出现的极短的寿命之外，非洲鳉鱼还有极短的性成熟时间（仅需2周）。不仅如此，为了应对旱季等极端环境，非洲鳉鱼的胚胎还能进入长达半年至5年的休眠。这些特征使其成为一个极具潜力的新模式动物，为发育和进化生物学研究提供新的洞见。
专家点评
董波（中国海洋大学，教授）
单细胞精度的海鞘细胞谱系追踪
细胞谱系追踪对于了解动物细胞命运选择和比较不同物种早期发育的演化关系具有至关重要的意义。海鞘由于身体结构简单（正在发育的胚胎仅由100-200个细胞组成，蝌蚪期幼虫含有约2500个细胞）成为研究细胞谱系、揭示器官起源和组织分化规律的重要模式，同时海鞘也是距离脊椎动物最近的海洋脊索动物【1】，其独特的进化地位成为回答发育进化问题的模式动物。早在1905年，美国生物学家Edwin G. Conklin便利用柄海鞘卵细胞质不同区域色素颗粒颜色存在差异，受精卵分裂时不同区域的细胞质分配到不同的裂球中，从而首次追踪了胚胎发育的细胞谱系【2】（图4），在发育生物学中具有里程碑意义。随后，Nishida Hiroki等人又通过显微注射等技术进一步建立了海鞘的细胞发育谱系【3】（图5）。然而如何获得发育过程中单细胞精度的细胞谱系图和发现新的细胞类型，仍是发育生物学研究的热点。
图5：利用显微注射和分子标记追踪获得的海鞘胚胎发育细胞谱系（Nishida et al.，1987）
来自普林斯顿大学的Levine Michael和Chen Kai（陈凯）领衔的团队，利用单细胞测序技术和计算方法，完整重建了玻璃海鞘胚胎发育过程的单细胞发育轨迹，这是继斑马鱼、非洲爪蟾和小鼠之后，完成的首个脊索动物单细胞精度的细胞谱系图【4】，对于了解海鞘的细胞谱系具有革命性的意义。
该项工作覆盖了海鞘从原肠胚到蝌蚪幼虫的10个发育阶段，分析了90,579个海鞘细胞的单细胞转录组测序结果，每个细胞的平均测序深度达到12倍，每个细胞平均鉴定到12，000特异表达的分子标记，测序结果显示，即使总数只有2个的游泳期幼虫生殖干细胞（占每个个体总细胞数0.1% ）也可准确捕捉到。通过对海鞘发育阶段单个细胞转录组数据的比对，他们重新建立海鞘胚胎和幼虫发育的细胞谱系，在蝌蚪幼虫期鉴定出60个不同的细胞类型，这些不同类型细胞对应的细胞谱系可以追溯到110细胞的原肠胚期。测序结果不但验证了传统实验获得的不同组织的特异性转录因子和基因，还新发现了许多组织特异性表达因子，这些信息对今后研究海鞘细胞命运决定和理解胚胎发育中的组织分化提供了重要参考资料。
脊索是脊索动物（包括半索、头索和尾索动物）的典型组织，也是无脊椎动物向脊椎动物进化的特征器官。头索动物文昌鱼终生保留脊索，其脊索是肌肉型脊索，同肌肉组织类似，具有收缩、驱动机体游泳运动功能。而脊椎动物的脊索是不具有收缩功能的非肌肉型脊索。那么进化上距离脊椎动物更近的尾索动物的脊索是什么类型呢？尾索动物海鞘的脊索细胞来源自初生（A lineage）和次生（B lineage）脊索2个细胞谱系，该项工作的单细胞测序结果揭示：一些转录因子如OTX 和Not特异性表达在次生脊索细胞（B lineage）中。更有意思的是，肌肉决定因子Tbx6a, Tbx6c，Tbx6d家族转录因子及其下游驱动的肌肉特征标记基因如calsequestrin, myosin, tropomyosin等特异性地表达在次生脊索细胞（B lineage）中而不在初生脊索（A lineage）中表达。这些结果表明海鞘幼虫同时具有头索动物的肌肉型脊索细胞和脊椎动物非肌肉型脊索细胞，是处于组织类型转换阶段的“混合型” 过渡脊索。这一结果为组织器官演化提供了重要证据。
海鞘幼虫神经系统较为简单，只有177个神经元，此项工作分析了22,198个神经细胞，通过重建单个神经元细胞转录组轨迹，将177个神经元分类为41个神经细胞亚群，并通过将单细胞转录组与突触组的整合，鉴定了神经细胞发育和神经回路的基因调控网络。进一步单细胞神经元的信息分析发现，脊椎动物端脑特征性标记基因表达在海鞘幼虫两个分离的组织：Dlx, FoxG, Sp8表达在海鞘幼虫身体前端的感觉突触上，而Six3/6，Otp，FoxJ1和Lhx2/9则表达在海鞘幼虫神经管前端。这一结果暗示脊椎动物的端脑可能来源于这两个分离组织的愈合。进一步的实验证实表达在海鞘幼虫前端突触上的 FoxG基因定位在脊椎动物（非洲鳉鱼）端脑的前部。这些发现提示端脑可能起源于神经管前端，为脊椎动物端脑的起源和进化提供了重要分子证据。
该项研究证实了海鞘细胞的分化方向在原肠胚期即全部确立，描述了不同类型细胞分化的不同组织类型，发现了新的潜在的细胞命运决定因子，并利用基因表达特征重构了海鞘的细胞谱系，对于认识脊椎动物器官起源和细胞类型的转换机制具有重要作用，也为进一步了解细胞的进化甚至制作出新的细胞类型奠定了重要基础。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1385-y
制版人：珂
参考文献
1. Delsuc et al., Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature, 439:965-968, (2006).
2. Conklin, E. G. The Organization and Cell-Lineage of the Ascidian Egg. Proc. Acad. Nat. Sci. Philadelphia 13, 1-119, (1905).
3. Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev Biol 121, 526-541, (1987).
4. Cao et al., Comprehensive single-cell transcriptome lineages of a proto-vertebrate. Nature. (2019).