专家点评NBT | 魏文胜组报道新型基因编辑技术
点评 | 周海波、杨辉（中科院神经所）、丛乐（斯坦福大学医学院）
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近年来，以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术在生物医学等诸多领域产生了深远的影响，但该技术目前存在的一系列问题使其在临床治疗应用中遭遇瓶颈。问题的根源之一在于当前的基因编辑体系依赖于外源编辑酶或效应蛋白的表达，从而造成：(1) 蛋白分子量过大使得通过病毒载体进行装载及人体内递送十分困难；(2) 由蛋白过表达引起的DNA/RNA水平的脱靶效应；(3) 由外源蛋白表达引起的机体免疫反应及损伤；(4) 机体内的预存抗体使外源编辑酶或效应蛋白被中和从而导致基因编辑失败等。为解决上述问题，亟需建立新型基因编辑工具，特别是摆脱传统技术依赖于外源蛋白表达的桎梏。
ADAR(Adenosine deaminase acting on RNA) 是一类在人体内各组织中广泛表达的腺苷脱氨酶，能够催化RNA分子中腺苷A→肌苷I（鸟苷G）的转换。相比DNA编辑，RNA编辑不需要对基因组序列进行永久性改变，这种可逆的、易于调控的编辑方式在安全性上可能更具优势。麻省理工学院张锋课题组曾报道，过表达Cas13-ADAR融合蛋白及向导RNA可以实现靶向目标RNA的精准编辑【1】，但是该方法无法解决外源蛋白表达造成的问题。
2019年7月16日，北京大学魏文胜课题组以长文形式在Nature Biotechnology杂志在线发表了题为Programmable RNA editing byrecruiting endogenous ADAR using engineered RNAs的研究论文，首次报道了名为LEAPER的新型RNA 单碱基编辑技术。与传统的核酸编辑技术需要向细胞同时递送编辑酶（如Cas蛋白）及向导RNA不同，LEAPER系统仅需要在细胞中表达向导RNA即可招募细胞内源脱氨酶实现靶向目标RNA的编辑。利用该技术，研究人员在一系列疾病相关基因转录本中实现了高效、精准的编辑，并成功修复了来源于Hurler综合征病人的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷细胞。该技术的建立为生命科学基础研究和疾病治疗提供了一种全新的工具。
魏文胜课题组在研究中首次发现，只需转入一条特殊设计的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能够通过招募细胞内源的ADAR1 蛋白对靶向基因转录本上特定的腺苷产生高效精准的编辑，并不需要引入任何外源效应蛋白。ADAR1基因敲除与回补实验和高通量测序分析表明，细胞内源的ADAR1 蛋白介导了这一过程。这种新型RNA编辑技术被命名为LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)。
深入研究表明LEAPER具有广泛的适用性，能对RNA分子上绝大多数的腺苷酸位点进行精准编辑。在人的原代细胞-包括肺成纤维细胞、支气管上皮细胞及T细胞中，LEAPER的编辑效率最高可达80%，显示出该技术在疾病治疗中巨大的应用前景。在诸多应用尝试中，LEAPER的高效、精准的特性得到充分验证。比如LEAPER可以通过修复抑癌基因TP53中的致病突变来恢复p53突变体的转录调节功能。此外，在Hurler综合征患者来源的原代细胞中，LEAPER能够成功修复致病突变，并恢复细胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。
近期的研究表明，DNA单碱基编辑技术，包括胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器在RNA或DNA水平上产生了严重的脱靶现象【2-5】，引发人们对其安全性的担忧。利用RNA-Seq技术在转录组水平对LEAPER技术进行的评估，没有观测到明显的脱靶现象，显示了新技术的高度特异性。另外，LEAPER不影响内源ADAR蛋白的正常功能，也不会激活细胞中的天然免疫反应，表明其是一类安全的基因编辑工具。
与RNAi类似，LEAPER充分利用了细胞中天然存在的机制：仅用一条RNA 就实现了精确高效的RNA单碱基编辑，从而避免了任何由于表达外源效应蛋白而引起的各种潜在问题。这种新型的基因编辑技术在科学研究和疾病治疗中显示出可观的优势与潜能，同时也为发展基于细胞内源机制的基因编辑技术指明了方向。近期，Thorsten Stafforst课题组报道了命名为RESTORE(recruiting endogenous ADAR to specific transcripts foroligonucleotide-mediated RNA editing) 的RNA编辑方法【6】。与LEAPER类似，RESTORE也能够利用内源ADAR进行靶向RNA的精准编辑；不同之处在于，RESTORE中的向导RNA是一段化学合成的寡核苷酸，为保持其稳定性，需要进行大量化学修饰。而LEAPER可以通过稳定表达的方式在细胞内发挥作用，因此适用于装载至腺相关病毒 (AAV)、慢病毒等载体中，在递送至机体后持续发挥功能。
北京大学魏文胜课题组博士生璩良(PTN)、伊宗裔(CLS)、王春慧(BIOPIC)、曹中正(CLS)、博士后朱诗优、副研究员周卓博士和博雅辑因生物科技有限公司袁鹏飞博士为该论文共同第一作者，魏文胜为该论文通讯作者。
专家点评
周海波、杨辉（中科院神经所）
RNA单碱基编辑是近年来广受关注的一项技术，因为 RNA水平的编辑不会产生永久突变，意味着其可能会作为一种更加安全的编辑手段。2017年，张锋实验室通过过表达Cas13b和ADAR融合蛋白实现了定点的RNA编辑，但是由于vector size非常大，很难递送到体内，而且大量表达外源性的Cas和ADAR有可能产生大量的脱靶甚至癌症，以及严重的免疫原性。其后Mali实验室进一步证明只过表达ADAR以及导向RNA也可以实现RNA编辑，虽然vector size问题了，但其他问题还是存在。今年初，Thorsten等开发了RESTORE，证明了只需要导入化学修饰的ASO就能实现RNA定点编辑，在之前的基础上迈出了一大步，但是ASO有效时间相对较短，所以非常有必要开发出一种长期安全有效的RNA编辑工具。
在最新发表的Nature Biotechnology中，魏文胜团队解决了上述的问题，非常巧妙的开发了LEAPER，LEAPER只需要导入改造的短arRNA就能招募内源性ADAR发挥功能。LEAPER不仅高效， 而且极少有脱靶，能在不同类型细胞中发挥功能。值得一提的是，LEAPER还可以通过包括化学合成以及病毒等不同方式递送，解决了RESCUE的问题。最后魏文胜团队成功的应用LEAPER在Hurler综合征病人原代细胞中修复了IDUA活性。这是一项非常令人欣喜的工作，但同时存在一些今后需要解答的问题：LEAPER是否能够在体内也能实现高效的编辑，并且缓解疾病表型？如果过多的内源性ADAR被集中招募到目标位点，在长时间内会不会影响其他位点正常编辑以及功能？
丛乐（斯坦福大学医学院）
北大魏文胜教授课题组在基因编辑领域从DNA编辑开始就一直处在科研最前沿，最新这篇来自他团队的新文章，开创了RNA编辑工具的新可能。更为强大的是，与之前利用CRISPR蛋白-RNA复合物实现RNA编辑相比，本文描述的Leverageing Endogenous ADAR for Programmable Editing or RNA，即LEAPER技术，使用了更为简洁的系统。概括而言，LEAPER技术将细胞本身ADAR家族RNA编辑蛋白的活性，通过人工引导ADAR的arRNA（ADAR-recruiting RNA）定位到目标RNA分子上，将A碱基编辑为I碱基（I与C实现更强配对从而改变该位置RNA序列）。随后通过系统的优化设计，不仅确立了arRNA的设计规律，还显著降低了脱靶效应，实现精确RNA编辑。
这篇文章的故事相当引人入胜，不仅开发了新技术，而且文章的出发点还揭示出之前CRISPR系统RNA编辑的实质可能并非我们所想的，不一定主要由CRISPR系统产生，而是源自于细胞本身ADAR的编辑效应。具体来说，作者的第一部分实验从dCas13-ADAR融合蛋白的RNA编辑系统入手，意外发现当仅在细胞中表达crRNA并不加入dCas13系统时，依然可以检测到RNA编辑，而且这种序列特异的效应随RNA增长而变强。更有趣的是，当加入dCas13系统时，可能因为dCas13能够结合crRNA从而干扰ADAR结合，反而会降低编辑效率。因此，作者进一步证明不使用crRNA而只使用arRNA也能实现有效RNA编辑。通过敲除ADAR蛋白的对比，文章证明这一活性依赖于内源ADAR蛋白。随后，为将这一技术应用于精确高效的RNA编辑，作者先后完成了arRNA设计的优化（Fig 2），细胞内源基因的多靶点RNA编辑（Fig 3)，并针对全转录组的特异性进行了完善检测（Fig 4），建立了从设计规则到检测脱靶问题的全面流程。最后文章进一步将系统包装到病毒后实现对多种原代细胞的RNA编辑，并对与人类疾病相关的TP53和IDUA基因突变成功进行了细胞内RNA编辑修复，验证了这一技术的临床应用潜力。
总结来说，这篇发表在Nature Biotechnology的研究长文，从基础生物学入手，进行了极为创新的技术开发、优化及其应用前景的发掘。回顾本文的精彩故事，有很多非常值得深入体会和欣赏的要点：（1）严谨完整的实验设计极为重要。领域中很多之前的RNA编辑文章会缺少关键的阴性对照，比如很少会做只使用RNA的对照组，只有Cas13蛋白或ntRNA（non-targeting RNA）阴性对照，无法检测并忽略了很重要的内源ADAR编辑效应；（2）看到问题后要通过探究背后的生物学机理进行技术创新，魏老师的团队并未停留在第一步，他们进一步理解内源ADAR的RNA编辑以及arRNA的设计方法，进行了一些列优化探索，实现对多种人类细胞和多基因位点的RNA编辑；（3）作为内源蛋白RNA编辑的开创性文章之一，本工作的价值还可以延展到后续更多的研究中，比如是否可以用此技术进行大规模文库筛选（这也是魏文胜教授课题组做出一系列重大贡献的领域之一）？是否可以进一步优化和提高这一系统的效率？这些精彩的后续故事也非常值得我们期待。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41587-019-0178-z
制版人：小娴子
参考文献
1. Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung J,Zhang F. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 2017 Nov24;358(6366):1019-1027.
2. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, Ying W, Sun H, Yuan L, Steinmetz LM, Li Y,Yang H. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotidevariants in mouse embryos. Science. 2019 Apr 19;364(6437):289-292.
3. Zhou C, Sun Y, Yan R, Liu Y, Zuo E, Gu C, Han L, Wei Y, Hu X, Zeng R, LiY, Zhou H, Guo F, Yang H. Off-target RNA mutation induced by DNA base editingand its elimination by mutagenesis. Nature. 2019 Jul;571(7764):275-278.
4. Jin S, Zong Y, Gao Q, Zhu Z, Wang Y, Qin P, Liang C, Wang D, Qiu JL,Zhang F, Gao C. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wideoff-target mutations in rice. Science. 2019 Apr 19;364(6437):292-295.
5. Grünewald J, Zhou R, Garcia SP, Iyer S, Lareau CA, Aryee MJ, Joung JK.Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA baseeditors. Nature. 2019 May;569(7756):433-437.
6. Merkle T, Merz S, Reautschnig P, Blaha A, Li Q, Vogel P, Wettengel J, LiJB, Stafforst T. Precise RNA editing by recruiting endogenous ADARs withantisense oligonucleotides. Nat Biotechnol. 2019 Feb;37(2):133-138.