NBT | 杨弋/朱麟勇团队开发Pepper拟荧光蛋白RNA
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在生物大分子中，RNA具有独特的结构和种类繁多的生物学功能，与人类重大疾病的发生和发展密切相关。近年来RNA生物学研究进展迅速，不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、起源、功能与调控已经成为了国际研究前沿，而siRNA, RNA适配体及最新出现的CRISPR/Cas9等基于RNA的基因操作、分子识别技术也是国际生物技术应用的重要热点。这些研究不仅革新了人们对许多生物学基本概念和基本问题的认知，而且在生命科学、生物工程和医学中具有广阔的应用前景。
细胞内的RNA像DNA一样由四种碱基来编码，其序列容易测定，因此近年测序技术的发展极大推动了RNA研究的进展。另一方面，RNA又像蛋白质一样具有复杂的四级结构与相互作用，具有特定的时间、空间分布及不同的转录后修饰状态。如何对活细胞RNA特异标记与成像，实时监测RNA在活细胞中各种行为，如生成、运输、定位、降解等，这是深入研究RNA功能机制极为有用的工具和需要解决的重要技术挑战【1-3】。
虽然荧光原位杂交技术【2】，或是酶反应催化的RNA化学共价标记技术【4,5】（图1A）均可用来标记RNA，但这些技术目前只能用于固定化细胞亦即死细胞的研究，不适合对活细胞内RNA进行分析。利用分子信标技术可以对活细胞RNA进行标记成像（图1B），但其存在着荧光背景高、细胞核内非特异性聚集、易受RNA二级结构的影响、需要对每条RNA专门定制合成寡核苷酸探针等困难【1,2】，至今还难以完全解决。RNA系链 (tethering) 标记系统则是通过MS2, PP7, λN, CRISPR/Cas9等RNA结合蛋白与特定RNA序列的相互作用，将多个荧光蛋白系链到靶标RNA分子上，通过跟踪荧光蛋白的信号示踪靶标RNA【6-10】（图1C）。但没与靶标RNA结合的融合蛋白会扩散到整个细胞中，进而产生很强的背景荧光，干扰真实的RNA含量与分布信息；为了获取足够信号，通常需要在RNA的上融合数十个拷贝的RNA结合蛋白的结合序列【11】，可能会影响其融合的靶标RNA的功能。目前，分子信标技术和RNA系链标记技术还是主要用于活细胞内具有重复序列的RNA单分子分析。
荧光蛋白可帮助研究人员“照亮”蛋白质在活细胞与活体中的各种行为，这极大地促进了蛋白质科学的研究。荧光蛋白标签的美妙之处在于它可以与目的蛋白融合，实现简单直接的荧光标记。在短短十余年内，荧光蛋白技术研究即被授予诺贝尔奖。同理，RNA研究也迫切需要一种与荧光蛋白类似，简单、直接与普适性的活细胞与活体标记方法。自然界尚未发现天然存在的荧光RNA。2003年诺奖得主钱永健首次提出利用核酸适配体特异性结合染料并激活其荧光的方法（图1D），这种”荧光RNA”可以与目标RNA融合，有望在活细胞内实现任意RNA分子特异性的直接标记。十余年来，科学家们一直试图针对核酸染料如孔雀绿、Hoechst、硫黄素，或是荧光团-淬灭基团染料等发展人工合成的荧光RNA。但由于这些染料荧光本底高、透膜性弱等问题，仅有少数种类被报道可用于动物细胞内少数高丰度、聚集态或具有大量重复序列RNA的成像。基于荧光蛋白生色团的“拟荧光蛋白RNA”则克服了背景与染料透膜的问题【12-14】，但这些荧光RNA亮度、稳定性又很低，在动物细胞内同样只能用于高丰度或聚集态RNA的成像。迄今为止，RNA研究领域还没有出现类似于荧光蛋白这样简单有效，普遍适用的活细胞荧光标记工具。
理想的荧光RNA应该是单体、高度稳定、高亮度、低背景、多种颜色。只有在各方面的性能均取得突破性进展后，荧光RNA才会从概念走向实用。针对这一亟需解决的技术挑战，2019年9月23日，华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室、光遗传学与合成生物学交叉学科研究中心杨弋教授课题组与朱麟勇教授课题组为主组成了化学生物学交叉学科联合攻关团队，历经七年紧密合作，最终在荧光RNA研发领域取得了突破性进展。该研究成果以Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs为标题，发表在了Nature Biotechnology杂志上。
研究团队认为此前荧光RNA性能不佳的最大原因在于染料分子本身，结构复杂的核酸染料分子在细胞内背景过高；而拟荧光蛋白生色团等分子虽然背景低， 但其分子量小且柔性大，使得它们很难被RNA固定。因此，研究团队首先基于全新的分子设计理念开发了一类创新的HBC染料分子，它们具有树枝状、刚性结构，理论上会相对容易被RNA结合固定（图2a-c）。利用SELEX（指数富集的配体系统进化）技术，研究团队筛选优化获得了仅含40余个核苷酸的RNA分子片段，可高度特异结合不发光的创新染料分子，进而产生强烈荧光。这些荧光RNA的颜色与辣椒类似，它们具有蓝绿色、黄色、橙色及红色等不同颜色，因此被命名为Pepper。进一步的结果表明，Pepper是以单体且非G四链体的结构形式与染料分子结合，且有着纳摩尔级的高亲和力，高温度稳定性、强pH耐受性，以及对外源序列融合插入的高度兼容性。Pepper的这些优良性质使得它在细胞中的荧光亮度、激活倍数要比现有的最好的拟荧光蛋白RNA高出至少一个数量级，亲和力与稳定性高出两到三个数量级（图2d-g）。此外，研究团队发现可将多个Pepper以串联的方式进行融合，这种Pepper串联体的单分子荧光强度随着Pepper拷贝数的增加呈等比例上升，这就将成像检测的灵敏度又提高了一个数量级。
Pepper不仅可被用于细胞中表达丰度较高的5S、7SK等非编码RNA的活细胞成像（图3），同时还可用表达水平更低的mRNA的无背景成像，而不影响这些RNA的转录、定位、翻译、降解等正常代谢。成像结果显示，包浆蛋白与核定位蛋白的mRNA主要分布于细胞浆中，而很多内质网蛋白以及膜蛋白的mRNA呈现内质网定位（图3），表明它们的定位与其功能发挥密切相关，这一结果与此前利用高通量测序得到的结论一致。
图3. Pepper用于活细胞中多种RNA的成像。
Pepper还可与时下火热的CRISPR技术结合起来，通过sgRNA展示的方法利用Pepper对基因组特定位点进行活细胞成像。进一步的结果显示，随着展示的Pepper的拷贝数的增加，单个位点的荧光亮度也显著提高，这为低拷贝基因位点的成像标记提供极富潜力的工具。此外，由于Pepper与染料分子的结合是非共价的，因此可以通过加入不同染料的方法，随意改变细胞内荧光RNA的颜色（图4），这种灵活性对于多色荧光标记稳定细胞株和转基因动物的构建十分有利。
图4. Pepper用于基因组位点成像。
进一步地，研究团队利用蛋白质系链的方法改变RNA本身的定位，而将它们捆缚到不同的亚细胞结构中，并实现RNA定位动力学变化过程的实时监测。受益于Pepper的高亮度和强稳定性，研究团队首次实现了活细胞荧光RNA的超分辨成像（图5）。
图5. Pepper用于活细胞RNA超分辨成像。
由于Pepper具有活细胞RNA无背景定量检测的特性，研究团队还在国际上首次利用Pepper对单细胞中mRNA的翻译过程进行大规模定量研究（图6a）。结果显示单细胞内蛋白质翻译过程符合经典的米氏酶动力学方程，mRNA与其编码蛋白水平之间存在显著相关性。但同时单细胞蛋白质翻译过程也存在强烈的生物噪声，这种生物噪声强烈依赖于mRNA种类、细胞性质与状态（图6b, c）。有趣的是，癌细胞中mRNA水平与其编码蛋白水平之间的相关性显著降低（图6d），提示癌细胞的翻译调控显著失调，这为癌症的诊疗提供了新的思路。
图6. Pepper用于单细胞分析解析mRNA含量与其编码蛋白质量的相关性。
综上，与现有技术相比，杨弋教授与朱麟勇教授团队研发的荧光RNA在亲和力、稳定性、信噪比、活细胞荧光亮度等方面提升了一到三个数量级，体现了荧光RNA从概念到实用的突破，为活细胞中RNA的功能研究提供极具价值的工具。此外，这些荧光RNA与适配体技术相结合，原则上可以针对任意信号分子、代谢物、蛋白质等靶标发展从蓝色到红外的高响应度荧光探针，其性能将有望大幅超过现有基于荧光蛋白的遗传编码荧光探针，为活细胞与活体生物传感、即时诊断甚至实时诊断技术的发展提供新的机遇。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-019-0249-1
制版人：珂
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