Immunity | 吕奔团队解密细菌感染诱发凝血反应的机制
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凝血（Coagulation）不仅在生理性止血过程中起关键作用，而且在机体抗感染免疫反应中也扮演了重要角色。在革兰氏阴性细菌感染过程中，细菌来源的内毒素（脂多糖：LPS）能引起组织因子（tissue factor, TF）的表达与活化，从而快速启动凝血反应，形成血管内血栓并阻止细菌通过血循环进行播撒。但当细菌大量侵入血循环造成全身性重症感染（脓毒症）时，失控的凝血反应将发展成为弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）。DIC表现为全身广泛微血管内血栓形成、微循环障碍、多脏器衰竭和后续的继发性出血，是一种危及生命的重症状态，死亡率极高。然而，重症细菌感染诱发DIC的致病机理尚不甚清楚，目前在临床上缺乏特效的治疗方法。
中南大学湘雅三医院吕奔课题组前期研究发现：在重症感染（脓毒症）中，肝细胞释放的HMGB1蛋白作为分子伴侣能将血循环中的内毒素（LPS）转运至细胞浆中，从而活化了LPS的细胞浆受体—Caspase-11并引起致死性免疫反应【1】。该团队近期还发现Caspase-11的过度活化在急性移植物抗宿主病所致的多脏器衰竭中发挥重要作用【2】。基于上述发现，吕奔课题组进一步探讨了Caspase-11途径在细菌感染所致DIC中的作用。
2019年12月10日，中南大学湘雅三医院吕奔教授团队在Immunity上以“Bacterial Endotoxin Activates the Coagulation Cascade through Gasdermin D-Dependent Phosphatidylserine Exposure” 为题，阐述了Caspase-11及其酶切底物—Gasdermin D（GSDMD）在细菌感染诱发DIC过程中发挥的关键作用，揭示了革兰氏阴性细菌诱发DIC的分子机制，为今后脓毒症DIC的防治提供了新的思路。
Caspase-11活化后将其底物GSDMD裂解成肽段；后者能在细胞膜上聚集形成GSDMD孔道。既往的研究表明GSDMD孔道具有以下两个重要免疫功能：1）介导炎症因子—白介素-1的释放；2）表现为细胞裂解的细胞程序性死亡（细胞焦亡，pyroptosis）。在该研究中，作者发现了GSDMD孔道的另一重要生物学功能：通过钙离子内流介导磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻，从而激活TF和启动凝血反应。
该研究团队首先应用活体显微镜检测技术直接观察内毒素动物模型小鼠血管内凝血酶生成、血小板聚集、纤维蛋白沉积，及肝肺微小血管闭塞情况，发现敲除Caspase-11能显著抑制LPS诱导的上述凝血反应（图1）。通过检测内毒素血症小鼠DIC相关指标，作者进一步证实了Caspase-11在LPS诱导的DIC模型中的发挥重要作用。接下来，该课题组采用大肠埃希杆菌注射及盲肠结扎穿孔两种脓毒症模型对上述DIC相关血清学指标进行了验证，结果发现Caspase-11在革兰阴性细菌脓毒症DIC形成中同样发挥重要作用。
图1：Caspase-11是革兰阴性细菌诱发DIC的关键蛋白分子。
既往研究报道，LPS活化Caspase-11后主要通过剪切GSDMD或者剪切Pannexin-1活化P2X7介导免疫细胞焦亡。然而，该课题组发现：LPS诱导的凝血活化主要是依赖GSDMD而并不依赖P2X7（图2）。
图2:内毒素诱导的凝血活化主要是依赖GSDMD而并不依赖P2X7。
GSDMD 是如何参与内毒素诱导的凝血活化？接着该课题组首先分别应用TF低表达小鼠（TF为小鼠生存所必须）和TF中和抗体证实TF蛋白表达及活性的升高在LPS诱导的DIC过程中发挥重要作用，而敲除Caspase-11或GSDMD均显著抑制内毒素血症小鼠TF的活性，但不会影响TF转录和蛋白水平的表达。鉴于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻能显著增强TF的活性，该团队检测了GSDMD在PS外翻中的作用，并发现：敲除GSDMD将会显著抑制外周血白细胞及脾脏细胞PS外翻；中和细胞膜表面的PS则能抑制凝血的活化。此外，GSDMD调控TF活性及PS外翻的结论在细胞实验中亦得到证实。
接下来该课题组进一步探讨了GSDMD导致PS外翻的分子机制，发现GSDMD介导的钙离子内流在促进PS外翻及上调TF活性中发挥了关键作用（图3）。通过GSDMD膜孔内流的钙离子能激活跨膜蛋白16F（TMEM16F）。后者为一种磷脂翻转酶，能直接介导PS的外翻并随后增强TF的促凝活性（图3）。
图3：GSDMD介导的细胞PS外翻及提升促凝血活性机制模式图。
为了证实上述研究发现是否与临床脓毒症DIC病理生理过程一致，该课题组收集了一定的临床样本进行了统计学分析，发现GSDMD激活的标志物（白介素1）与白细胞PS的外翻及DIC相关指标呈密切相关（图4）。
图4：GSDMD活化的标志物与白细胞PS外翻及DIC相关指标呈密切相关
综上所述，该研究发现了GSDMD是细菌感染诱发凝血反应的重要分子，揭示了细菌感染所致DIC的重要分子机制，为今后脓毒症DIC早期诊断治疗提供了研究方向，也为今后开发GSDMD相关分子作为潜在药物干预靶点提供理论依据。
据悉，杨新宇博士和博士研究生程晓烨为该论文的并列第一作者；吕奔教授为该论文的通讯作者。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.11.005
参考文献
1. Deng, M., Tang, Y., Li, W., Wang, X., Zhang, R.,Zhang, X., Zhao, X., Liu, J., Tang, C., Liu, Z., et al. (2018). The EndotoxinDelivery Protein HMGB1 Mediates Caspase-11-Dependent Lethality in Sepsis.Immunity 49, 740–753.
2. Lu Y, Meng R, Wang X, et al. Caspase-11 signalingenhances graft-versus-host disease. Nat Commun. 2019;10(1):4044.