Cell Research背靠背 | 李海涛、陈忠周团队分别发文揭示哺乳动物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作机制
责编 | 小柚
6mA是哺乳动物基因组中除5甲基胞嘧啶及其衍生物（5mC，5hmC，5fC，5caC）之外的又一类表观修饰，被称为哺乳动物基因组第九碱基。基因组6mA的水平在早期胚胎发育和癌症发生等过程中呈现出剧烈波动，其背后的调控机制是解码这一新型修饰碱基生物学功能的关键。
2016年，耶鲁大学Andrew Xiao教授实验室曾在Nature发文首次报道ALKBH1具有DNA 6mA的去甲基化酶活力【1】。但自1996年ALKBH1被克隆以来，其生理底物一直存在巨大争议（相关争议详见此前报道：特别推荐丨单分子测序在真核生物DNA甲基化(6mA)检测中的机遇和挑战；Mol Cell | 又见新的DNA 6mA催化酶！），相关结构亦未解析，亟待进一步研究，另外也有报道称ALKBH4是DNA 6mA的去甲基化酶（相关争议详见此前报道：Mol Cell | 又见新的DNA 6mA催化酶！）。此外，围绕DNA 6mA修饰的催化酶很长时间也存在争议，近日，MD Anderson程晓东团队在Cell Discovery杂志上发表文章Human MettL3-MettL14 complex is a sequence specific DNA adenine methyltransferase active on single-strand and unpaired DNA in vitro，揭示了在体外条件下，MettL3-MettL14复合物可催化ssDNA和bubble DNA上特定序列（GGACT）的6mA的修饰，为相关研究提供了新的可能【2】，另外，近日哈佛大学施扬教授团队在Cell Research上发表文章报道了过去被认为是DNA 6mA催化酶的METTL4实际上是snRNA上m6Am修饰的甲基转移酶。那么回过头来问，ALKBH1如果是DNA 6mA去甲基化酶，那么其中的机制和结构生物学基础是什么呢？
2020年2月12日，清华大学医学院李海涛研究组与Andrew Xiao教授实验室在Cell Research期刊以长文形式报道了题为“Mammalian ALKBH1 serves as an N6-mA demethylase of unpairing DNA”（哺乳动物ALKBH1是一类非配对DNA的N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶）的研究论文。该研究通过建立稳定可靠的体外酶活检测体系，首次鉴定出ALKBH1为一类局部非配对DNA的N6-甲基腺嘌呤（6mA）去甲基化酶（图1）；首次解析了ALKBH1自由态以及与DNA底物的复合物结构，揭示了ALKBH1偏好局部非配对核酸底物的结构基础，为哺乳动物基因组第九碱基6mA的调控生物学提供了全新的研究视角。
图1. ALKBH1偏好局部开链DNA并催化6mA的去甲基化
ALKBH1是Fe(II)-α-酮戊二酸双加氧酶超家族中AlkB家族的成员，与5mC去甲基化酶Tet家族存在很近的亲缘关系。在本研究中，研究者首先建立了基于液相-质谱（LC-MS/MS）的定量酶活检测体系，系统地检测了ALKBH1对各类核酸底物的去甲基化酶活，发现ALKBH1偏好催化局部开链的鼓泡DNA而非单链DNA中6mA的去甲基化，且完全无法催化双链底物的去甲基化（图2）；进一步实验表明，ALKBH1可以同样高效催化多种局部非配对核酸（如bulge、R-loop、D-loop和stem loop等）中6mA的去甲基化，而对碱基序列没有特别偏好，首次阐明了ALKBH1对底物二级结构的高度依赖性。同时，研究者建立的基于寡链核酸的质谱测活方法，成功捕获了6mA去甲基化过程的中间产物N6-羟甲基腺嘌呤（6hmA），为ALKBH1催化的化学机理提供了新证据。6hmA在非酶促条件下，可以稳定存在数小时，提示6hmA有可能作为一种亚稳态表观修饰参与调控。
图2. ALKBH1识别与催化非配对DNA 6mA去甲基化的生化结构基础
其它AlkB家族成员以及Tet家族成员均未表现出对局部非配对核酸的偏好，那么ALKBH1这种独特底物偏好的结构基础是什么呢？如图2所示，ALKBH1由位于C端的催化结构域（DSBH）、相邻的底物识别亚结构域（NRL）以及N端的延长区域（NTE）构成，其中NRL亚结构域又细分为Flip1和Flip2两部分。研究者首先解析了2.5 Å的ALKBH1自由态结构，发现其Flip1远离酶活中心且外翻伸展，这与其它AlkB家族成员以及Tet2“回扣式”的Flip1构象形成了鲜明反差。已有研究表明，“回扣式”Flip1构象对于稳定双链DNA修饰碱基外翻，促使其伸向活性中心完成催化有着重要作用。ALKBH1中Flip1的伸展构象导致其失去了自主外翻DNA碱基的能力，因此ALKBH1无法催化双链DNA底物，而其酶活发挥需要碱基的预先翻转。
随后，研究者通过定点交联策略，使原本结合较弱的ALKBH1和凸起DNA底物形成稳定、均一的复合物，并最终在2.4 Å分辨率水平解析了复合物晶体结构（图2）。结果表明， ALKBH1伸展的Flip1与其N端的α1位于催化中心两侧，分别与翻转碱基左右两侧的双链区域互作。其中，α1和Flip1上的R24和R159残基分别以“精氨酸手指”方式插入双链区域的小沟中，协助将DNA凸起中外翻的修饰碱基呈递至催化中心实现去甲基化。复合物结构解析突显了局部非配对底物双链区在ALKBH1底物识别过程中的关键作用，阐明了ALKBH1偏好催化局部开链核酸底物而非单链底物的原因。研究者进一步对小鼠早期胚胎发育细胞进行DIP-seq以及ssDNA-seq分析，发现N6-mA与基因组的非配对区域存在着显著的共定位，暗示着N6-mA的调控可能与真核生物染色体高级结构的动态变化密切相关，这将为后续ALKBH1以及N6-mA的功能研究提供全新的视角。
据悉，清华大学李海涛教授以及耶鲁大学Andrew Xiao教授为共同通讯作者。李海涛实验室张敏博士（清华-北京生命科学联合中心2015级博士研究生）、医学院博士研究生杨舒敏以及耶鲁大学博士研究生Raman Nelakanti为本文共同共同第一作者。第二作者2018级PTN联合项目博士生赵文涛同学和清华代谢质谱平台的刘晓蕙老师为本工作的顺利开展作出了重要贡献。
在同期Cell Research上，中国农业大学陈忠周教授与中科院生物物理所闫小雪发表了文章Structural basis of nucleic acid recognition and 6mA demethylation by human ALKBH1，通过晶体结构解析了hALKBH119–369, hALKBH119–369-Mn2+和hALKBH119–369-Mn2+-α-KG结构。hALKBH119–369拥有针对ssDNA上6mA的去甲基化酶活性，但不能参与dsDNA上6mA或者ssDNA上m1A的去甲基化。研究人员还发现尽管hALKBH1可以结合dsDNA，但N-端Flip0结构域（19-32残基）可以阻止dsDNA进入hALKBH1的活性中心，在其识别特异性底物ssDNA 6mA中扮演了重要作用。该研究揭示了hALKBH1的结构和天然底物，有助于进一步了解DNA表观修饰进程和开发相关疾病的药物。
总的来说，相关工作揭示了ALKBH1偏好局部非配对核酸底物的结构基础，为哺乳动物基因组上极富争议的6mA修饰的调控生物学提供了新的研究视角。然而，围绕哺乳动物以及其其它低等生物如线虫和果蝇中DNA 6mA修饰的生物学意义和功能的争议并没有解除，目前围绕DNA 6mA全基因组检测的相关方法学上仍然面临不小的挑战，该领域仍然亟待更多的研究理清科学的本来面貌。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41422-019-0237-5
https://doi.org/10.1038/s41422-019-0233-9
参考文献