张锋实验室公布CRISPR程序检测COVID-19的详细方案
试剂：重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒（TwistAmp®Basic；TABAS03KIT)；ProtoScript®II逆转录酶（M0368L）；裂解缓冲液（在ddH2O中为400mM Tris pH 7.4）；RNA酶抑制剂；T7 RNA聚合酶；核糖核苷酸溶液套装；氯化镁溶液；用于稀释Cas13蛋白原液的存储缓冲液（结合2.5 mL 1M Tris pH 7.4、6mL 5M NaCl，2.5 ml甘油和100μL1M DTT和38.9 ml ddH2O）；LwaCas13a蛋白；HybriDetect试纸条（MGHD 1)。
设备：37℃水浴锅、42℃水浴锅、微量离心机，适配1.5mL EP管。
引物：
靶向S基因的RPA扩增引物对
S-RPA-Forward_v1：
5’-GAAATATACTACGACGACTGATCACATACTACTTCTGTT TACATAGA-3’；
S-RPA-Reverse_v1:
5'-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3'；
针对Orf1ab引物对
Orf1ab-RPA-Forward_v1：
5’-GAATAATATACGACTACGGAGGAGTGTGAGATAGACATAT
ActAAAC-3’；
Orf1ab-RPA-Reverse_v1:
5'-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3'；
用于检测S基因的LwaCas13acrRNA
S-crRNA_v1：
5’-GuuuAgAccCCAAACAGGAGGACUCAAACAGCGACCAC
AGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3；
用于检测Orf1ab基因的LwaCas13acrRNA
Orf1ab-crRNA_v1：
5’-GuuuaGaCuCCAAACAGGAGGGACUACAUACACUCUCU
UCUGUAAUUUUUAAACUAU-3'；
读出横向血的报告基因RNA：
Lateral-Flow-Reporter：
5'-/56-FAM / mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3'；
阳性对照序列（可以使用T7转录从合成的DNA寡核苷酸产生）：
新冠病毒S基因片段：
5'UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUCUCUUUAAUAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUGACUGUACAGAUGCUGAGAU
新冠病毒Orf1ab基因片段：
5'GAAAUUAAUACGACUCACUAUAGGGACUCUUGAAACUGCUCAAAAUUCUGUGCGUGUUUACAGAAGGCCGCUAUAACAAUACUAGAUGGAAUUUCACAGUAUUCACUGAGACUCAUUGAAUUGCUAUGACUUCAUGAUGAUUCACAUCUGAUUUGGCUACUAACAUAUAUACUAUGACUUGAUCUGAUCUGAUCCUAU
B实验步骤：
提示：为防止样品污染，需使用两个不同的工作区域来执行步骤（1）和（2）。步骤（1）应该在前置放大区域中进行，其对污染非常敏感。请勿在步骤（1）的工作区域中打开扩增的样品，步骤（2）、步骤（3）需要一个单独的区域（扩增后区域）执行。所有反应应在指定温度下孵育之前在冰上进行。
步骤（1）等温扩增：
1、为了测试每个样品，设置两个RPA反应，分别检测S基因靶标和Orf1ab靶标。此外，可以使用合成病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应建立不添加测试样品的阴性对照。使用RPA试剂盒中提供的29.5ul的Rehydration Buffer重悬每个冻干的RPA沉淀。
2、对于S基因，可以如下设置每个反应：
溶液名称 | 体积（微升） |
Resuspended RPA solution | 5.9 |
S- RPA-PROTEDVIV1（10μM） | 0.5 |
S- RPA-ReVIESEV1（10μM） | 0.5 |
PrimScript RT（100000 0U/ml） | 0.2 |
ddH2O | 0.4 |
待测样本 | 1 |
MgAc（RPA Kit中提供） | 2.5 |
总体积 | 11 |
3、对于Orf1ab基因，可以如下设置每个反应：
溶液名称 | 体积（微升） |
Resuspended RPA solution | 5.9 |
ORF1AB-RPA-PROTEDVIV1（10μM） | 0.5 |
ORF1AB-RPA-ReVIESEV1（10μM） | 0.5 |
PrimScript RT（100000 0U/ml） | 0.2 |
ddH2O | 0.4 |
待测样本 | 1 |
MgAc（RPA Kit中提供） | 2.5 |
总体积 | 11 |
4、充分混合后，在预热的水浴中于42°C孵育25分钟。孵育结束后，立即将EP管放回冰上，直到准备加入步骤（2）中的反应中。
步骤（2）使用Cas13检测病毒RNA序列
1、取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样（2 mg/mL，4 ul），使用122.5 uL的存储缓冲液重悬。
2、对于每个S基因RPA反应，按以下步骤建立Cas13检测反应：
溶液名称 | 体积（微升） |
裂解缓冲液（400mM Tris pH 7.4） | 2 |
ddH2O | 9.6 |
LwaCas13a蛋白（重悬） | 2 |
S- CRRNAYV1（10 ng/UL） | 1 |
横向流量报告仪（20 uM） | 1 |
RNase抑制剂 | 1 |
T7聚合酶 | 0.6 |
核糖核苷酸溶液 | 0.8 |
氯化镁（120mM） | 1 |
步骤（1）的RPA反应溶液 | 1 |
总体积 | 20 |
3、对于每个Orf1ab基因RPA反应，如下设置Cas13检测反应：
溶液名称 | 体积 |
1.裂解缓冲液（400mM Tris pH 7.4） | 2微升 |
2. 二次蒸馏水 | 9.6微升 |
3. LwaCas13a蛋白（重悬） | 2微升 |
4. ORF 1AB-CRRNAYV1（10 ng/UL） | 1微升 |
5.横向流量报告仪（20 uM） | 1微升 |
6. SUPERase•In RNase抑制剂 | 1微升 |
7. Lucigen T7聚合酶 | 0.6微升 |
8.核糖核苷酸溶液 | 0.8微升 |
9.氯化镁（120mM） | 1微升 |
10.步骤（1）的RPA反应 | 1微升 |
总 | 20微升 |
4、设置完所有反应后，涡旋充分混合，并使用台式离心机离心，接下来在预热的37°C水浴锅中于孵育30分钟。孵育后，将反应管放回冰上，继续进行步骤（3）。
步骤（3）–通过试纸条直观地读取检测结果
1、步骤（2）之后，向每个20ul反应物中添加80ul HybriDetect分析缓冲液并充分混合，将稀释的反应液置于室温下的管架中。
2、将HybriDetect试纸条放入每个反应管中，然后等待反应流过试纸条。
3、阳性对照样品应显示两条线，而阴性对照样品应仅显示底线。
4、对于每个测试样品，检查S和Orf1ab基因是否都出现两行，表明新冠病毒结果呈阳性。