核心提示：Science论文以惊人的速度正式发表，该论文于美国当地时间2月10日投稿（预印本2月15上线），2月17日接收，2月19日在线发表。特别值得注意的是，经过Science论文研究团队的授权，BioArt于文末提供了相关蛋白PDB文件下载链接，供广大研究人员使用。另外，该论文共同第一作者Wang Nianshuang（王年爽）博士撰写一段该研究的介绍和心路历程附在文末，供读者参考阅读。新型冠状病毒2019-nCov的爆发引起了人们对于此突发性公共卫生事件的高度关注。冠状病毒的刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）是疫苗、治疗性抗体的研发以及临床诊断的关键靶点。
为了协助对该流行性疾病进行医学防护措施研发，2020年2月19日，美国德克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组（McLellan组在病毒结构方面做了很多重要的工作，包括MERS等，有着丰富的经验）在Science杂志正式发表了题为Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation的文章（此前该文章于2月15日在预印版平台bioRxiv发布），利用冷冻电镜技术分析了新型冠状病毒表面S蛋白的近原子结构。另外作者们通过生物物理以及结构方面的证据发现，SARS-CoV-2的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）【1,2】的亲和力要远高于SARS-CoV的S蛋白，解释了新型冠状病毒传染性之强的主要原因。新型冠状病毒是会引发发热、严重呼吸道疾病及肺炎的人传人的病原体【3,4】。截止到发稿时间，感染人数已经超过五万人。而新型冠状病毒与17年前爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒极为相似【5,6】。而且，相较于SARS来说，新型冠状病毒的更加快速的人传人并迅速传播到各个大洲的现象使得世界卫生组织将此次疫情爆发列为国际关注的突发公共卫生事件【7】。新型冠状病毒利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞。S蛋白经历结构变化将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜。此过程包括病毒的S1亚基结合到宿主细胞受体上，引发三聚体不稳定性的发生，进而造成S1亚基脱落S2亚基形成高度稳定的融合后结构【8】。为了对新型冠状病毒的S蛋白预融合的结构进行解析，作者们利用已经公开的2019-nCoV的序列（图1）通过亲和层析和凝胶排阻层析进行体外蛋白纯化。通过收集和处理3,207张蛋白图像后，作者们对蛋白进行了3D结构重组，获得了3.5 Å分辨率的“向上”蛋白质结构（图2）。为了接近宿主细胞受体，S1亚基中的受体结合结构域（Receptor-binding domain，RBD）会经历铰链类似的构象移动用以隐藏或者暴露受体结合的关键位点。“向下”结构代表了受体不可结合状态，而“向上”结构则代表了受体可结合状态，“向上”结构处于较为不稳定的状态【9】。通过该结构分析，作者们发现S1亚基中的RBD经历铰链类似运动，此移动特点与SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型冠冠状病毒中则RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其S蛋白中3个RBP中的1个会向上螺旋突出从而让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。这也说明，新型冠状病毒引发病毒的机制虽然与其他的冠状病毒科的病毒机制异曲同工，但传染性更强。将新型冠状病毒S蛋白的结构与SARS的S蛋白结构进行比较后作者们发现，两者之间结构最大的不同位于“向下”结构中的RBD结构域(图3 绿色结构区域)之中。SARS 的S蛋白中“向下”结构中RBD紧贴NTD结构域。虽然存在结构上的不同，但是整体上来说，新型冠状病毒与SARS-CoV在结构上还是高度相似的。图3 新型冠状病毒与SARS-CoV的结构异同比较除了SARS病毒之外，新型冠状病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13在S蛋白中序列同源性高达96%。但新型冠状病毒S蛋白中最显著的变化是具有S1/S2蛋白酶切割位点的“RRAR”（弗林蛋白酶识别位点）氨基酸序列，而不是像SARS病毒中仅具有单个精氨酸【10】。这一现象在流感病毒中较为普遍，其中高毒力禽流感病毒和人流感病毒常发生流感血凝素蛋白的关键位置上产生多聚弗林蛋白酶位点的氨基酸插入（BioArt注：围绕弗林蛋白酶识别位点的谣言可以打住了）。除了在S1/S2连接处的氨基酸残基差异外，新型冠状病毒和RaTG13 S蛋白还存在29个氨基酸残基的差异，其中17个位于受体结合的RBD部位。另外，先前有报道发现新型冠状病毒与SARS病毒共享相同的宿主细胞受体ACE2【2】，作者们希望进行动力学方面的检测以进一步确认两者之间的不同。令人惊讶的是，新型冠状病毒结合ACE2的亲和力要远高于SARS病毒的亲和能力（>10-20倍。注：此前有预印本上的基于计算的结果与此结论相反）（图4）。新型冠状病毒对ACE2的高亲和力也进一步解释了该病毒能够快速人传人的原因【3】。由于新型冠状病毒与SARS病毒之间的结构同源性，作者们希望对已经发表的SARS病毒的RBD单克隆抗体对新型冠状病毒的RBD进行交叉反应性测试。但是作者们发现，尽管两病毒RBD之间结构高度相似，但是SARS病毒的RBD抗体对于新型冠状病毒并没有明显的结合。SARS RBD的单克隆抗体对于新型冠状病毒不具有交叉反应，该结果与为新型冠状病毒S蛋白作为未来抗体分离与治疗方案的设计提供了重要的参考。论文通讯作者Jason S. McLellan博士总的来说，Jason S. McLellan研究组的工作从近原子的分辨率对新型冠状病毒的S蛋白进行了解析，为进一步精确地疫苗设计以及抗病毒药物的发现提供了重要的结构生物学基础，大大促进了全球对于新型冠状病毒相关医疗对策的发展。该文章于2月15日曾上传到bioRxiv之上后，迅速引发了科学家们对于此结构生物学文章的关注（据推特上该实验室透露的信息，整个工作12天内完成，详见下图）。博士生Daniel Wrapp与博后Nianshuang Wang是文章的共同第一作者，为了文章中新型冠状病毒病毒S蛋白结构的迅速解析付出了重要努力。另外针对于S蛋白的疫苗已有VRC/NIAID（变态反应和感染性疾病研究所疫苗研究中心）的科学家进行研发和测试。另外，值得一提的是，来自西湖大学的周强研究组于北京时间2月19日凌晨在bioRxiv上发表文章，报道了利用冷冻电镜技术成功解析此次新冠病毒的受体——ACE2的全长结构（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.17.951848v1）。文章共同一作Nianshuang Wang博士在微信朋友圈写到：文章出来了（指预印本），媒体反应快的我有点措手不及。主要数据都比较clear，没有特别需要说的。这个其实没遇到多大阻力，当然主要得益于之前几年打下的基础。从七年前的MERS到现在的新冠病毒，似是一个轮回。跨过两次冠状病毒爆发的同时，伴随两个年轻实验室一起成长并走向成熟。主要技术方法在四年前就已经奠定。当时那篇文章花了我十倍以上的心血。为了稳定S蛋白，尝试了上百个不同的design。最终选择了两个Pro突变，能把表达量提升50倍，稳定性和免疫原性大大提高。并且作为一种通用的技术手段对大部分种类的冠状病毒都适用。这可以说是“结构指导的疫苗设计”对冠状病毒的一次成功尝试，也可以很轻易的移植到一种新发冠状病毒。并且文章中还解析了与第一个也是目前唯一一个靶向S2抗体的复合物结构。可惜在当时不被重视，在那个时候也不被认可，阴差阳错经历了将近一年的投稿。再之后，看到别的实验室开始关注这个design，用同样的方法稳定S蛋白，发了Cell，NSMB等牛刊。然后有公司开始关注，有了各种合作。再然后，同样的设计帮助我们用最快时间解析了新冠病毒结构。发文章很重要，但是能够留下一些东西给这个领域，能够给这个社会带来一些改变，那才是更重要的。希望能给病毒阴影下的国人带来希望。我们一直在努力！
论文共同第一作者王年爽博士。王博士于2014年在清华大学结构生物学中心获得博士学位，导师为王新泉教授。据悉，2014年4月，在王新泉教授的指导下，王博士曾以共同第一作者身份在Science Translational Medicine杂志发表了题为Potent Neutralization of MERS-CoV by Human Neutralizing Monoclonal Antibodies to the Viral Spike Glycoprotein （针对中东呼吸系统综合征冠状病毒表面S蛋白的人源高效的中和抗体）的研究论文，这是国际上首次报道关于中东呼吸系统综合征冠状病毒（MERS-CoV）的人源的单克隆中和抗体。清华大学张林琦教授课题组江力玮为论文共同第一作者。温馨提示：上述文章在bioRxiv上发布后，研究团队收到了大量询问2019-nCoV S结构的PDB文件的邮件，尽管作者已经将相关结构放到了PDB，但是需要等待一些时日才能被发布出来。因此，为满足国内广大科研攻关小组的迫切需要，BioArt通过与论文作者沟通，决定将2019-nCoV S结构的PDB文件放置在云盘上（7日内有效）供国内相关课题组参考使用，希望共享的相关成果能有助于加速新冠病毒的疫苗研制与疾病防治。PDB数据链接: https://pan.baidu.com/s/1puTaeHuYEr8k62Anj0SsAA https://science.sciencemag.org/content/early/2020/02/19/science.abb2507https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.11.944462v11. Li, W. et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426, 450-454, doi:10.1038/nature02145 (2003).
2. Hoffmann, M. et al. The novel coronavirus 2019 (2019-nCoV) uses the SARS-coronavirus receptor ACE2 and the cellular protease TMPRSS2 for entry into target cells. 2020.2001.2031.929042, doi:10.1101/2020.01.31.929042 %J bioRxiv (2020).
3. Chan, J. F. et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30154-9 (2020).
4. Chen, N. et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30211-7 (2020).
5. Lu, R. et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8 (2020).
6. Wu, F. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, doi:10.1038/s41586-020-2008-3 (2020).
7. Li, Q. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med, doi:10.1056/NEJMoa2001316 (2020).
8. Walls, A. C. et al. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 11157-11162, doi:10.1073/pnas.1708727114 (2017).
9. Walls, A. C. et al. Unexpected Receptor Functional Mimicry Elucidates Activation of Coronavirus Fusion. Cell 176, 1026-1039 e1015, doi:10.1016/j.cell.2018.12.028 (2019).
10. Belouzard, S., Chu, V. C. & Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 5871-5876, doi:10.1073/pnas.0809524106 (2009).