特别关注 | 基因编辑技术在类器官中的应用
撰文 | 十一月
责编 | 兮
类器官可以由诱导多能干细胞、胚胎干细胞或者成体干细胞产生【1】。成体干细胞来源的类器官具有自组装的3D结构，也能够代表性地表现出不同器官的细胞组成以及不同组织的功能。对于一些基因敲入小鼠品系来源的类器官，由于通过基因敲入对目标基因加上了不同的“标签”，使得此类类器官能够成为回答多种生物过程中未解之谜的重要的、可视化的工具【2-4】。然而，精确整合外源性DNA序列到人源类器官仍然缺乏稳健的敲入方法。
2020年3月2日，荷兰Hubrecht Institute的Hans Clevers研究组在Nature Cell Biology杂志上发表文章Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依赖的CRISR-Cas9技术快速高效地对人源类器官进行基因敲入，作者们将该技术命名为CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，为人源类器官的内源基因敲入提供了重要的工具平台。
依赖于同源修复（Homology directed repair, HDR）进行基因敲入利用的是细胞进行DNA双链断裂修复的分子机制。通过CRISPR-Cas9技术可以在特定位置引入双链断裂位点。HDR对于靶向插入来说是最常用的方式之一，但是此过程的效率不高而且要求细胞要处于S期【5】，这大大限制了科学家们利用此技术进行基因敲入。另外，有研究表明CRISPR激活的DNA双链断裂会引起TP53的损伤响应以及诱导暂时的细胞周期滞留现象【6】。实验发现，如果使TP53失活，会增加细胞中HDR介导的基因敲入的效率。因此，为了提高基因敲入的效率，有的实验方法会建议通过抑制TP53的活性解决效率低下的问题【7】。
非同源性末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)也是DNA修复系统之一，但与HDR不同的是，NHEJ在所有的细胞周期中均活跃进行，并且不需要克隆同源臂。由于NHEJ被认为是容易出错的DNA修复系统，因此在此之前科学家们对于其在精确的转基因插入中作用没有引起重视。为了避免细胞周期限制、提高基因编辑的效率，作者们将目光放在了NHEJ介导的基因敲入技术，利用NHEJ介导的基因敲入对不同人成体干细胞类器官进行了基因敲入，为在内源水平对靶标基因的可视化研究提供了利器。
为了检测利用NHEJ介导的CRISRP-Cas9技术在人类器官中进行基因敲入的方法是否可行以及与HDR介导的方式之间的对比（图1），作者们首先建立了两种难以进行转染的人类器官：肝脏导管类器官及肝细胞类器官，并对此两种不同介导方式的基因敲入技术产生的类器官进行靶标基因测序确认。作者们发现，从基因敲入效率来看，NHEJ在两种类器官中的靶标基因敲入效率都要高于HDR介导的基因敲入方式。而且，即使是在抑制TP53的活性之后，虽然HDR介导的基因敲入方式的效率略有提高，但仍然比NHEJ介导的基因编辑效率要低，并且NHEJ介导的基因编辑技术不依赖于对TP53活性的抑制，进一步简化了基因敲入的流程也减少了其他遗传操作可能带来的副作用。
除此之外，作者们还利用NHEJ介导的CRISPR–HOT技术对目标基因加上荧光标签，建立了人肝脏导管类器官的报告基因品系，可以利用活体成像、切片染色等方式可视化观察内源表达的基因表达模式以及动态变化过程。另外，利用CRISPR–HOT技术也可以对多种罕见的肠道细胞来源的类器官进行靶标基因标记，用以研究这些基因在体内的功能和调节状况。
一直以来，在肝脏细胞中有丝分裂纺锤体的定位和正确极性的建立以及纺锤体组织结构之间的调节是备受争议的问题。作者们利用基因敲入的肝细胞类器官从三维的角度对肝细胞的分裂以及纺锤体建立之间的关系进行了研究。通过建立纺锤体以及组成型基因敲入的双报告基因系统，作者们对肝细胞类器官的动态细胞分裂过程进行了监测。作者们发现，在体外肝细胞分裂过程中，不是静止的而是有很大的变化，纺锤体的位置在细胞周期前中期和胞质分裂这两个时期的位置相似，而在这两个时期中间纺锤体轴向随着时间的推移发生显著旋转。另外，作者们还发现大多数的细胞（95%）二倍体肝细胞分裂，少数单核细胞（2–3%）分裂后变成一个双核细胞，另外还有极少数情况会形成一个三极性的纺锤体结构，最终形成一个单核细胞和一个双核细胞（图2）。TP53在维持基因组的稳定性中发挥着关键的作用，在肝细胞中敲除TP53会造成多倍体以及非整倍体的出现。作者们发现，在敲除TP53后，肝细胞类器官中肝细胞的纺锤体会出现异常。这进一步说明了CRISPR–HOT技术的应用可以避免HDR介导的基因编辑技术对于TP53活性抑制的依赖，减少了不必要的遗传背景的介入。
图2 双报告基因肝细胞类器官中肝细胞分裂的不同方式
总的来说，Hans Clevers研究组的工作建立了不依赖于同源臂的基因编辑技术，以NHEJ为蓝本建立了新颖的、稳健的基因敲入技术CRISPR–HOT，破除了之前技术对于特定细胞周期的依赖提高了基因编辑的效率，而且也去除了基因编辑方式对于TP53活性抑制的依赖，对于肝细胞等成体干细胞来源的类器官可视化研究提供了可靠的基因编辑方式。
值得一提的是，2月20日，Hans Clevers研究组在Cell Stem Cell进行发文，题为CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank，利用CRISPR依赖的单碱基编辑技术，对荷兰的囊性纤维化疾病（Cystic Fibrosis）病人样品建立起的类器官生物库中的样品的致病基因CFTR（CF transmembrane conductance regulator gene）基因中的突变进行编辑和修复，为临床上囊性纤维化疾病尤其是相对罕见的突变的修复提供了相匹配的治疗方案，同时也为体外进行大规模药物筛选并对病人进行个性化医疗方案的设计提供了重要的数据库（图3）。
图3 囊性纤维化病人类器官生物库的建立、药物筛选以及基因编辑修复
参考文献