Nature背靠背 | 张志斌/刘志博/邵峰等揭示细胞焦亡在肿瘤免疫方面的全新功能

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细胞焦亡（Pyroptosis）是最近受到广泛关注的一种程序性细胞坏死 （Programmed Necrotic Cell Death）。与免疫沉默的细胞凋亡（Apoptosis）不同，细胞焦亡以细胞膜破裂为特征，诸多细胞因子和危险信号分子在细胞焦亡中被释放，激活免疫系统，导致炎症反应。膜穿孔蛋白Gasdermin D（GSDMD）做为细胞焦亡的执行者，能够被半胱天冬蛋白水解酶Caspase-1/4/5/11切割【1,2】，切割产生的GSDMD N端片段多聚化，并在细胞膜上穿孔，从而导致细胞焦亡的发生【3,4】。GSDMD介导的细胞焦亡是拮抗病原感染的重要先天免疫反应，但过量则能够导致包括败血症在内的多种疾病。人类Gasdermin 家族一共有六个成员，包括GSDM A-D, GSDME（又名DFNA5） 以及DFNB59。研究表明GSDM A-E 都具有膜穿孔（Pore-forming）活性，能够在细胞中诱导细胞焦亡【4】。但除了GSDMD，其它的GSDM 蛋白如何被激活，以及它们的生物学功能都不清楚。最近的研究表明GSDME 能够被Caspase-3 切割激活，从而导致细胞凋亡到细胞焦亡的转换【5,6】。然而GSDME 的生物学功能以及体内激活它的上游通路都有待进一步的研究。
2020年3月11日，哈佛医学院及波士顿儿童医院Judy Lieberman研究组在Nature杂志在线发表题为“ Gasdermin E suppresses tumor growth by activating anti-tumor immunity”的论文，报道了来自杀伤细胞（Killer Cells）的颗粒酶Granzyme B（GzmB）能够直接切割GSDME，激活癌细胞细胞焦亡，而细胞焦亡的发生进一步激活抗肿瘤的免疫反应，抑制肿瘤生长。本研究中，哈佛医学院讲师张志斌博士与张莹博士为本文的共同第一作者， 张志斌博士和美国艺术与科学院院士Judy Lieberman 博士为本文的共同通讯作者。该研究组曾于2016年在Nature发文报道GSDMD的膜穿孔活性，揭示细胞焦亡的分子机制【3】。

之前的研究表明GSDME 的启动子在多种癌症细胞中被甲基化，这一表观修饰抑制了GSDME在癌细胞中的表达【7】。这一观察让作者推测GSDME可能抑制肿瘤生长。在本研究中，作者首先分析并检测了TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库癌症病人样品中GSDME 的基因突变。在检测的22个突变中，大部份突变降低了GSDME诱导的细胞焦亡，进一步暗示GSDME可能参与肿瘤抑制。之后作者通过四种小鼠肿瘤模型，直接证明了癌细胞内GSDME的表达能够显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。同时，与对照组相比，GSDME表达的肿瘤内有更多的自然杀伤细胞（Natural Killer Cells）以及CD8阳性杀伤T细胞（CD8 Cytotoxic T Killer Cells），并且这些负责清除肿瘤细胞的杀伤细胞比对照组表达更多的毒性蛋白和细胞因子，更为活跃。
作者进一步发现在免疫缺陷小鼠以及自然杀伤细胞和CD8阳性杀伤T细胞缺失的小鼠中，GSDME对肿瘤的抑制作用消失了，表明这一抑制作用依赖于免疫系统中的这两种杀伤细胞。杀伤细胞内存在大量的毒性颗粒（Cytotoxic Granules），内含大量的穿孔蛋白Perforin以及颗粒酶Granzymes。在识别癌细胞后，杀伤细胞能够释放体内的毒性颗粒内容物。在穿孔蛋白Perforin的帮助下，颗粒酶被运送到癌细胞中，切割一系列底物（包括Caspase-3），从而引起细胞凋亡。穿孔蛋白Perforin的缺失则能够完全抑制杀伤细胞通过颗粒酶诱导的细胞凋亡。作者发现在Perforin缺失的小鼠中，GSDME对肿瘤的抑制作用同样消失了，进一步证明GSDME的肿瘤抑制效应是由杀伤细胞介导。通过小鼠接种实验（Vaccination），作者证明GSDME肿瘤细胞中有细胞焦亡发生，并且细胞焦亡是一种免疫性细胞死亡（Immunogenic Cell Death）。

固有观点认为杀伤细胞通过细胞凋亡清除癌细胞或感染细胞，但在本研究中，通过杀伤细胞与目标癌细胞的共孵育，作者证明了杀伤细胞能够在高表达GSDME的癌细胞内诱导细胞焦亡，并且细胞焦亡的发生依赖于毒性颗粒内容物的释放。然而Caspase抑制剂以及Caspase-3抑制剂都只能部分抑制杀伤细胞诱导的细胞焦亡，暗示存在不依赖于Caspase-3的GSDME 激活通路。

GzmB是杀伤细胞毒性颗粒中丰度最高的颗粒酶，它的底物包括Caspase-3。在含有GSDME的细胞裂解液中，作者发现重组GzmB蛋白能够特异诱导GSDME 的切割，并且在Caspase 抑制剂存在或者在Caspase-3缺失的情况下，这一切割只是被部分抑制。但突变掉Caspase-3切割位点（270位的天冬氨酸），则切割被完全抑制。进一步研究表明重组GzmB能够直接切割重组GSDME蛋白, 且其切割位点与Caspase-3切割位点一致。通过在GSDME细胞以及GSDME缺失细胞中加入Perforin 和GzmB, 作者进一步在细胞中验证了GzmB对GSDME 的切割以及由此诱导的依赖于GSDME 的细胞焦亡。
最后，在小鼠肿瘤模型中，作者分别用正常的GSDME，膜穿孔活性缺失的GSDME （F2A）, 以及切割位点突变的GSDME （D270A） 进行了互补实验。结果表明只有正常的GSDME 能抑制肿瘤生长，而其它突变GSDME都与对照组无显著差异，表明GSDME的肿瘤抑制及免疫激活功能依赖于GzmB/Caspase-3诱导的GSDME细胞焦亡。

总而言之，该研究揭示了GSDME的全新生理功能及其内源激活机制，阐明了细胞焦亡在肿瘤免疫中的重要作用，为肿瘤治疗提供了新的思路。
在同期Nature杂志上，来自北京大学应用化学系的刘志博课题组和来自北京生命科学研究所邵峰课题组合作发表了题为“A bioorthogonal system reveals antitumour immune function of pyroptosis”的研究论文，通过新型生物正交体系同样揭示了细胞焦亡的抗肿瘤免疫功能。

这篇文章的研究思路与前一篇不同，该工作前期主要基于刘志博实验室开发的生物正交体系。刘志博实验室前期的工作发现一类含硼氨基酸探针（18F-硼氨酸）在肿瘤上有显著且特异的摄取，并将其用于临床中脑瘤的早期诊断和精确划界限。在最新的这项研究中，研究人员在细胞以及活体水平上构建了苯丙硼氨酸（Phe-BF3）介导的生物正交剪切系统，赋予硼氨酸探针激活功能，并通过“双靶向激活”策略实现了肿瘤选择性的蛋白功能调控。
由于邵峰实验室前期发现的Gasdermin蛋白在介导细胞焦亡过程中发挥关键的调控作用，Gasdermin蛋白被激活后在细胞膜上打孔导致细胞发生焦亡，诱导了强烈的炎症反应。研究人员运用前述的生物正交剪切系统，揭示少部分的肿瘤细胞发生焦亡，就足以有效调节肿瘤免疫微环境，进而激活很强的T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，该发现为肿瘤免疫治疗药物研发提供了新的思路，Gasdermin家族蛋白也成为潜在的肿瘤免疫治疗的生物标志物，这类蛋白的激动剂则很有可能成为抗肿瘤药物研发的新方向。
从另一个角度来讲，基于三氟化硼脱硅反应的“双靶向激活”策略效率高、生物正交性好的优势，揭示了将探针改造为激活剂这一设想在活体蛋白激活上的巨大潜力。
据悉，刘志博实验室的博士生王钦阳和邵峰实验室的博士后王玉鹏是本文的共同第一作者，刘志博博士和北京生命科学研究所邵峰博士是本文的共同通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2071-9

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2079-1

制版人：琪酱

参考文献

1.Shi, J.et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determinespyroptotic cell death. Nature 526, 660-665,(2015).

2.Kayagaki,N.et al. Caspase-11 cleavesgasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature 526,666-671,(2015).

3.Liu,X.et al. Inflammasome-activatedgasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores. Nature 535,153-158,(2016).

4.Ding,J.et al. Pore-forming activity andstructural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535,111-116,(2016).

5.Rogers,C. et al. Cleavage of DFNA5 bycaspase-3 during apoptosis mediates progression to secondarynecrotic/pyroptotic cell death. Nature communications 8, 14128,(2017).

6.Wang,Y. et al. Chemotherapy drugs inducepyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature 547,99-103,(2017).

7.deBeeck, K. O., Van Laer, L. & Van Camp, G. DFNA5, a gene involved in hearingloss and cancer: a review. The Annals ofotology, rhinology, and laryngology 121,197-207,(2012).