专家点评丨杨辉/黄鹏羽合作组首次证实Cas13d系统在成体动物体内具有靶向沉默RNA的活性
点评丨魏文胜（北京大学）、李大力（华东师范大学）
责编 | 迦溆
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室又发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割【1】。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c和Cas13d【2,3】。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特的优势，因而成为近年来的研究热点。
Cas13蛋白最直接的应用是靶向沉默RNA。目前Cas13a, Cas13b和Cas13d均被证实可以在哺乳动物细胞系中干扰RNA，从而实现基因沉默【2,3】。其中，2018年由加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现的Cas13d家族蛋白CasRx由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白【2】。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）【2】。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。此外，CasRx与其他Cas13家族蛋白相比，不仅具有最高的RNA切割活性，还具有最小的体积，使其更易于包装到AAV中以进行体内递送。
Cas13的另一个潜在应用是治疗RNA病毒感染。事实上，CRISPR/Cas本身就是细菌和古生菌抵御病源物质（如病毒）的免疫机制【4】。人们已经在哺乳动物细胞上验证了利用CRISPR/Cas9靶向消除病毒DNA【5,6】。然而，许多RNA病毒（如新冠病毒SARS-CoV-2，SARS冠状病毒，MERS冠状病毒，甲流病毒等）在整个生命周期中并不存在DNA。针对于此，最近，美国哈佛大学医学院Pier Paolo Pandolfi教授提出了利用Cas13d系统来治疗新冠病毒感染的可能性【7】。Pier Paolo Pandolfi实验室对中国、美国、澳大利亚19例新冠病人的病毒基因组分析结果表明，新冠病毒的序列在传播过程中依然在发生变化【7】。因此靶向新冠病毒的药物和疫苗均存在失效的风险。不仅如此，从2002年爆发的重症急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV），2012年开始出现的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），去年末开始爆发的SARS-CoV-2，到自然宿主动物体内冠状病毒的序列分析，都一再表明冠状病毒一直在快速进化成不同的种类，未来也有新的RNA病毒在人群中传播的可能。而Cas13d如果能应用于RNA病毒感染的治疗中，将可以简单地改变引导RNA，一方面可以快速响应病毒的新突变，另一方面也可以快速响应新的RNA病毒疫情。事实上，Cas13已经被证实在哺乳动物细胞中具有抗脑膜炎病毒ICMV、甲型流感病毒IAV和水疱性口炎病毒VSV的能力【8】。Cas13d在植物中的抗RNA病毒能力也获得了验证【9】。这些研究结果为Cas13d应用于RNA病毒的治疗提供了巨大的想象空间，但Cas13d是否可用于抗新冠病毒的治疗还有待进一步的实验支持。
目前关于Cas13的研究都是在体外细胞系中进行的。但更为关键的问题是Cas13是否能在成体动物的体内发挥功能并应用于疾病的治疗。2020年3月18日，上海科技大学黄鹏羽实验室与中科院神经科学研究所杨辉实验室合作，在Protein & Cell杂志发表题为Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver的研究论文，首次利用Cas13d家族蛋白CasRx在小鼠肝脏中实现了基因的高效沉默，从而证实Cas13d系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性。
他们将Cas13d系统和靶向Pten基因的guide RNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在肝脏细胞中沉默了Pten基因，并通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了相关糖脂代谢相关基因的表达。这说明Cas13d可以应用于模拟体内代谢信号的调控。此外，研究者利用Cas13d系统，成功地降低了小鼠血液中的胆固醇水平。低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平升高是冠状动脉疾病及动脉粥样斑块形成的主要危险因素之一【10】。在体内，肝脏分泌的PCSK9通过与低密度脂蛋白受体 (LDLR) 结合，降低了肝脏从血液中清除低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的能力。因此PCSK9是降胆固醇药物开发中最受关注的靶点之一。在此项研究中，研究人员利用AAV递送Cas13d和靶向PCSK9的引导RNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，并成功降低了小鼠血液中的胆固醇水平。与此同时，研究人员并没有观察到明显的肝损伤，说明Cas13d系统在体内应用时具有一定的安全性。另外，研究者也证实，基于Cas13d的基因沉默是可逆的，这在针对后天性的代谢疾病治疗中具有显著的优势。
值得一提的是，中科院神经科学研究所杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作在预印本平台bioRvix发表，近日已经被National Science Review接收（ACCEPTED MANUSCRIPT状态）的另一项题为CasRx-mediated RNA targeting prevents choroidal neovascularization in a mouse model of age-related macular degeneration 的工作中探究了使用CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性。他们发现使用CasRx体内敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，提供了将RNA靶向CRISPR系统用于治疗应用的潜力的概念验证。年龄相关性黄斑变性（AMD）是50岁以上成年人视力下降的主要原因【11】。在诊所中，AMD的当前治疗很大程度上取决于重复（例如每月）人源化抗-VEGFA抗体的注射【12,13】，以及与重复注射相关的伤害。在这项研究中，他们使用了一次AAV注射来敲低Vegfa mRNA，这种作用在理论上可以长期持续（长达2年）。
除了成体动物，最近西班牙奥拉维德大学Miguel Moreno-Mateos团队也在预印本网站bioRxiv上发布他们的研究，证实Cas13d在斑马鱼等多种动物的胚胎中也具有高效的RNA沉默能力。近期关于Cas13d的一系列成果的公布，将有助于推动Cas13d的应用，同时也说明Cas13d的有效性和广阔的应用前景正在被大家逐渐认识。
原文链接：
https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-020-00700-2
https://academic.oup.com/nsr/advance-article/doi/10.1093/nsr/nwaa033/5775464
北京大学魏文胜教授点评
近几年，继靶向DNA的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12系统之外，靶向RNA的CRISPR/Cas13系统也开始受到关注。利用CRISPR/Cas13靶向RNA的特点，有多个研究组分别报道了基于CRISPR/Cas13的RNA敲低、RNA成像和RNA编辑等技术。最近，上海科技大学的黄鹏羽课题组与中科院神经科学研究所的杨辉课题组合作报道利用CRISPR/Cas13d系统（CasRx系统）在小鼠肝细胞中实现了多基因的敲低，在此基础上通过利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体对CasRx系统进行小鼠体内递送，实现了对代谢相关基因Pcsk9的有效敲低，并观察到了血清胆固醇的改变。
利用CRISPR/Cas13系统对RNA进行编辑或者敲低，将不会对基因组产生永久性改变，因此适合一些代谢、免疫疾病中对基因表达或蛋白功能进行阶段性调控的需求。另外，CRISPR/Cas9系统中的Cas核酸酶分子量普遍较大，较难利用AAV载体实现体内递送。在本研究中，研究人员利用了蛋白分子量最小的一类Cas13家族蛋白—CasRx（～900个氨基酸），即使加上多个crRNA及其表达元件，也不会超过AAV病毒载体的包装限制, 易于实现体内递送。
另外，对于最近爆发流行的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染，当前的抗病毒治疗策略主要集中于小分子抑制剂和疫苗的研究。SARS-CoV-2是一类RNA病毒，利用靶向RNA的CRISPR/Cas13系统对病毒的基因组进行破坏，将是另外一种潜在的特异性抗病毒治疗手段。本文利用AAV这一安全递送系统，在小鼠体内证实了CRISPR/Cas13可以有效敲低目标RNA，为相关抗病毒策略的发展提供了一定依据。
华东师范大学李大力教授点评
目前已发现多个CRISPR系统具有非常强的特异靶向RNA编辑能力，然而RNA编辑系统在基因治疗中的应用非常有限，因此找到适合RNA编辑的应用场景对其将来的临床应用非常关键。杨辉和黄鹏羽课题组利用CRISPR/Cas13d在小鼠体内通过对正常基因的mRNA编辑，实现降低血液胆固醇含量，展现了该系统在治疗代谢性疾病方面的潜在应用，显示了RNA编辑在疾病预防和治疗中的广阔前景。
在这项研究中，研究者在细胞和动物体内导入CasRx（RfxCas13d）系统，实现了Pten和LncLstr等基因的显著下调，并引起下游基因和细胞信号的相应变化。同时发现相较于传统的RNAi技术, CasRx具有更高的特异性。利用AAV8将CasRX以及两条gRNA，成功地在小鼠肝脏中显著下调PCSK9的表达水平，将血液胆固醇含量降低到对照组的61%左右。最后作者证明该系统对于基因表达水平的调控是可逆的，通过两次注射gRNA实现多次精确下调目的基因的表达水平的目的。
对于RNA编辑将来的应用，该论文率先展示了Cas13d在体内的精确性和有效性。研究的讨论部分还指出，由于CasRx系统的底物为RNA，或许在将来可以利用这一点开发出针对RNA病毒的相关药物。例如SARS,MERS以及最近肆虐的新型冠状病毒（SARS-CoV-2)。由于RNA病毒总是在不断突变从而逃逸现有的抗病毒药物，而现有的测序技术结合CasRx系统或许能够快速针对某个突变体设计新的靶向RNA，从而应对病毒的抗药性。对于RNA病毒的基因编辑预防和治疗，Tuan M. Nguyen及其合作者也在最近的Cell Research上发表了类似策略，展现了Cas13d靶向2019-nCov (SARS-CoV-2)预防和治疗新冠肺炎的广阔前景。
除了文中提到的疾病，RNA编辑还可以用于一些遗传疾病的治疗。已经有不少研究在动物水平证明利用Cas9进行DNA编辑，重编程代谢通路从而治疗遗传代谢性肝脏疾病。例如通过敲除羟苯丙酮酸双加氧酶（HPD）治疗酪氨酸血症，通过敲除羟酸氧化酶1（HAO1）治疗高草酸尿症等等。DNA编辑直接敲除一个正常基因可能并不是最优的治疗方法，如果通过RNA编辑体系下调这些基因，为代谢类疾病的基因治疗提供了一种新的选择。将来，通过改进也许可以实现Cas13d的表达或活性随着疾病标志物的变化而进行相应调节，做到RNA编辑系统的自动控制，实现代谢性疾病的自主性治疗。
参考文献