特别推荐Neuron | 唐逸泉博士解析听觉受体如何感受机械力刺激——兼谈五种感觉受体（视听嗅味触）研究小史
撰文 | TYQ
责编 | 兮、迦溆
编者按
2020年4月22日，英国剑桥大学MRC分子生物学实验室William R. Schafer和唐逸泉博士（同为第一作者和共同通讯作者）在Neuron杂志上发表了文章Ankyrins Are Intracellular Tethers for TMC Mechanotransduction Channels，以线虫为研究对象，揭示了在神经元和肌肉细胞里，ankyrin分子可以作为细胞内的锚，把机械力传递给TMC蛋白（听觉感受器）。除了解读这篇文章之外，唐逸泉博士还总结了五种感觉受体——视听嗅味触，尤其是听觉受体背后的研究历史。BioArt强烈推荐给广大读者！小史精彩纷呈，值得收藏品读！
“Sight, touch, taste are all deceived in their judgment of you, But hearing suffices firmly to believe.”
— Thomas Aquinas “Adoro te devote”
古希腊哲学家亚里斯多德总结人类有五种感觉：视觉、听觉、嗅觉、味觉、触觉，并在他的哲学体系中，依此顺序对五感进行高低等级排序，此顺序也正好对应五种感觉器官在人体的高低位置，即从眼睛开始往下，直到作为主要触觉器官的手。而到了中世纪，由于基督教传道，听觉备受推崇。比如，天主教会认证的史上最伟大神学家，圣托玛斯·阿奎那（St. Thomas Aquinas，1225－1274）所写的赞美诗「我今虔诚朝拜」(Adoro Te Devote) 里就有这么一句：“眼见手摸口尝味，引我入迷途，独有耳能听正道，我乃成信徒。”
哲学、宗教和科学都是人类认识世界的方式。无独有偶，科学家在揭示五感背后的生物学机理时，除开听觉研究，研究进度也大致遵循了亚里斯多德的五感排序。
视觉研究步子迈得最快，19世纪就由德国生理学家Franz Christian Boll发现了光受体蛋白视紫红质rhodopsin在视网膜视杆细胞上的表达，之后美国科学家George Wald通过生物化学手段揭示rhodopsin感光的生化反应，并因此获得了1967年的诺贝尔生理学奖。
之后是嗅觉研究，美国科学家Richard Axel（【致敬】换方向后获诺奖的大师Richard Axel）和他的博后Linda B. Buck于1991年一起在Cell杂志上发表工作 A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition 【1】，发现了嗅觉受体分子家族。注意，当时那篇著名论文的标题用的还是may这种不确定的语气，直到1996年，Richard Axel后来的妻子，Cornelia Bargmann领导的当时还在UCSF的实验室在Cell杂志发表论文，以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为实验模型第一次证明了嗅觉受体确实可以特异识别嗅觉分子【2】。Linda B. Buck发表这篇后来让她和导师Richard Axel于2004年共享诺贝尔生理学奖的论文的时候已经44岁了。
嗅觉之后是味觉研究，基本味觉有五种，酸甜苦咸鲜，这个领域最主要的贡献者是美国科学家Charles S. Zuker和Nicholas Ryba，二人的实验室从2000年开始陆续发现了感受五种基本味觉的细胞类型以及除酸味以外的另外四种味觉的分子受体。酸味的分子受体则于2018年由南加州大学的Emily R. Liman实验室发现【3】。
21世纪的第二个十年，触觉受体浮出水面。2010年，美国Scripps研究所的Ardem Patapoutian实验室发现一类新的机械敏感离子通道，Piezo1和Piezo2【4】，并于2014年证明Piezo2是主要的触觉受体【5,6】。
听觉虽然在哲学和宗教文化中地位突出，可在科学研究上却相对有些落后。虽然早在1961年，Georg von Békésy就因为发现听觉器官——耳蜗（cochlea，这是个古希腊词汇，意思是蜗牛壳，因为cochlea的形状像是蜗牛的壳（图1），耳蜗这个中文翻译可谓是形神兼备）而获得诺贝尔生理学奖，可听觉受体的发现却不是那么顺利。
听觉受体不容易被发现自然是有原因的。
首先就是哺乳动物的听觉器官耳蜗深深地埋藏在最硬的骨头——颞骨里，很难被解剖研究。因此听觉受体研究的两位先驱，James Hudspeth和Robert Fettiplace 在上世纪70年代分别选择了牛蛙和乌龟作为他们的研究对象，因为这些生物个头相对较大，耳朵主要由软骨组成，易于解剖，且它们的听觉细胞毛细胞（hair cell（图2），这类细胞表明有一根根毛发状的小突起，因此被称为毛细胞，这些突起的学名叫静纤毛，stereocilium，是毛细胞上负责感受声波刺激的细胞器）也容易存活。事实上，Robert Fettiplace一开始选择的实验动物是鳄鱼，不过后来由于鳄鱼从美国进口容易出现断货（当时他的实验室还在英国剑桥），他转为使用乌龟。通过对牛蛙耳蜗里毛细胞的研究，James Hudspeth证明了毛细胞是如何通过其毛束（hair bundle，一般由20到300根静纤毛组成）上的机械传导通道感知声音的，并揭示了耳蜗里的外毛细胞是如何把传入耳蜗的微弱声音信号放大再传递给内毛细胞的。而Robert Fettiplace则通过对乌龟耳蜗里毛细胞的研究，揭示了耳蜗基底膜的不同区域分别对不同频率的声音做出反应，其中顶端区域对低频声音做出反应，基底区域对高频声音做出反应，就像钢琴的琴键一般。另外，Robert Fettiplace实验室还发现在哺乳动物中，声音信号的放大是由于外毛细胞的电运动，一类叫Prestin的电马达蛋白可以感受细胞膜电位变化而发生形变，从而使外毛细胞产生长度伸缩，并伴随着力的作用，通过直接拉扯增强了基底膜局部的振动，振动信号进而激活内毛细胞，引起听觉反应。James Hudspeth和Robert Fettiplace也凭借他们在理解听觉系统的生物物理学和生理学知识方面的重大贡献，和研究遗传性耳聋的法国遗传学家Christine Petit一起获得了2018年的卡弗里神经科学奖（Kavli prize in Neuroscience）。
听觉分子受体不容易被发现还有一个主要原因就是听觉细胞的数量特别少，举个例子，人类的耳朵里只有16000个毛细胞，而人眼视网膜里有一亿个感光细胞，这也不难理解，为什么视觉受体rhodopsin的发现要提前其他感觉受体这么多年了。由于听觉细胞数量少，所以生化实验非常难做，因此听觉系统的分子机制研究，基本依赖于遗传学。从上世纪90年代开始，很多参与听觉功能的重要基因都是首先从遗传性耳聋病人身上被鉴定出来，随后听觉研究者们在后续研究中发现这些基因在听觉中的具体作用以及其基因突变造成耳聋的生物学机制。
听觉的分子受体是什么？作为整个听觉研究的核心问题，所得到的关注也一直是最多的。首先大家很明确，听觉受体肯定是离子通道？为什么呢？因为很多动物都可以听到频率大于1000赫兹的高频声音，因此听觉受体的反应速度肯定小于1毫秒，这个反应速度不太可能是通过细胞内的第二信使系统介导，只可能是在毛细胞上有一种机械敏感型离子通道，可以直接对声波刺激做出反应。而且这个通道极其敏感，敏感到什么程度呢？James Hudspeth实验室在研究牛蛙的毛细胞的时候，用一根非常非常细（直径是0.5-0.8微米）的玻璃纤维，去拨动毛细胞的静纤毛，拨动的幅度有多小呢，Jim的形容是，相当于埃菲尔铁塔的塔尖移动了一个拇指的距离，如此细微的机械刺激，就足以激活静纤毛上的听觉受体通道蛋白。
过去的几十年间，听觉科学家们一直在苦苦寻找这个离子通道，且走了不少弯路。比如James Hudspeth的学生David P Corey于2004年在Nature发表论文，声称TRPA1通道是听觉受体【7】，不过不久后这一观点又被新的科学证据推翻。2002年，美国的Andrew J Griffith实验室和英国的Karen P Steel实验室分别在先天耳聋病人和耳聋老鼠模型（这个老鼠突变体模型被命名为贝多芬）身上发现同一个致病基因，这个基因叫做TMC1【8,9】。这个基因一被发现，由于属于一类新的膜蛋白家族，立刻引起了很多研究人员的关注。4年后，英国的Corné J Kros实验室发表论文，证明TMC1确实对于毛细胞的发育成熟以及存活很重要，但是在TMC1突变的毛细胞中，负责听觉感受的机械传导电流依然存在【10】。这一结果对很多人造成了误导，认为也许TMC1不是听觉受体蛋白。直到2011年，Andrew J Griffith实验室和Jeffrey R. Holt实验室一起发表论文，证明除TMC1之外，毛细胞中还有另一个TMC家族同源分子——TMC2。只有在把TMC1和TMC2同时删除的条件下，才能完全消除毛细胞的机械传导电流【11】。两年后，Jeffrey R. Holt实验室在Neuron杂志又发表一篇论文，证明TMC蛋白的表达以及TMC1的贝多芬点突变M412K（就是Steel实验室2002年报道的会引起老鼠耳聋的那个突变）可以影响毛细胞里的机械传导电流的生物物理门控特效，包括单通道电导以及钙离子选择性【12】。这一发现为证明TMC1是听觉受体蛋白提供了很强的依据。
不过彼时，关于TMC蛋白是否为通道，争议依旧很大。一方面是因为，除TMC1/2之外，其他一些分子对于毛细胞的机械传导也很重要，比如Ulrich Mueller实验室发现的LHFPL5和TMIE（第一作者发现者分别是目前任职清华大学的熊巍以及美国印第安纳大学的赵博），领域内存在争议，到底哪个分子才是组成通道孔区的核心亚基。另一方面是因为，Robert Fettiplace实验室在2013年发现，在TMC1和TMC2双敲除鼠的毛细胞中，虽然常规的机械传导电流消失，却出现了一种新的反向机械敏感电流【13】，因此当时大家怀疑，TMC蛋白可能只是帮助真正的通道亚基在毛细胞上准确定位的辅助亚基。不过几年后，Ulrich Mueller实验室的Zizhen Wu证明，这一反向机械敏感电流是由触觉受体Piezo2介导的，而Piezo2并不参与听觉感受【14】。争议中时间来到2018年，哈佛的Jeffrey R. Holt和他的博士后导师David P Corey实验室合作再度在Neuron杂志发表论文，证明TMC1蛋白可以形成二聚体，并预测其结构可能和另一类离子通道蛋白TMEM16很相似，且TMC1蛋白跨膜区S4-S7结构域可能构成了毛细胞机械传导通道的孔区【15】。哈佛的论文作者们认为这篇论文可以为TMC1是否为听觉受体的争议盖棺定论，并进行了一番大肆宣传。不过笔者认为，真正盖棺定论的证据，来自今年早些时候，复旦大学的闫致强团队、服部素之团队与东京大学教授濡木理团队的同样发表在Neuron杂志的一项合作研究（Neuron | 闫致强团队确立听觉首要机械力门控离子通道，五种感觉受体的最后一个谜团被解开）。他们把来自绿海龟的TMC1（CmTMC1）与来自虎皮鹦鹉的TMC2（MuTMC2）在昆虫细胞里表达并纯化，再重构在脂质体里进行电生理记录，证明了单纯的CmTMC1和MuTMC2蛋白也具备离子通道活性【16】。至此，对于TMC蛋白是否为听觉受体离子通道的争议算是告一段落。不过，依然有一个关键问题是，听觉受体是如何感受机械力刺激的，这也是笔者一直感兴趣的问题。
笔者2014年开始做博后的时候，主要对两个科学问题感兴趣，第一个是建立TMC蛋白的异源表达系统，证明其确实是离子通道；第二个是听觉受体感知机械力的方式。
James Hudspeth实验室早在上世纪80年代就证明机械力激活牛蛙毛细胞上的机械传导通道，需要通过拉伸一个锚定在细胞骨架和通道蛋白之间的弹性元件，这个弹性元件被称为门控弹簧（gating spring）【17,18】。但多年以来，关于这个门控弹簧具体是什么，一直存在争议。以James Hudspeth为首的一派学者认为毛细胞的静纤毛间的特殊结构——顶端连接（Tip Link）——是这个门控弹簧。不过也有很多证据不支持这一观点。比如，构成顶端连接的分子蛋白的物理性质可能过于刚硬了，不够有弹性，不符合弹簧的特性；有实验证据表明，破坏顶端连接，机械传导通道不是关闭，反而是打开了；只需要10-20 pN的力，就足以把一个膜蛋白从细胞膜里扯出来，因此机械传导通道需要一个细胞内的锚（tether）将其固定在细胞骨架上，才能承受从顶端连接传递过来的机械力；果蝇和线虫的TMC同源基因也参与机械感受，但果蝇和线虫细胞并没有顶端连接这种毛细胞特有的细胞结构。
因此，笔者在2014年以TMC1的胞内N端片段为饵，用小鼠的内耳cDNA文库为捕猎对象，进行酵母双杂交筛选，从中发现两个分子，CIB2和CIB3，二者皆属于钙离子与整合素结合蛋白 （CIB, calcium and integrin-binding protein）家族，其中CIB2的突变会引起遗传性耳聋【19】。接下来笔者联系最初发现CIB2耳聋突变的Zubair M Ahmed实验室（Zubair Ahmed博士也是Tip link其中一个分子成分PCDH15的最早发现者）合作，共同发现CIB2也是小鼠毛细胞上机械传导通道的基本组成之一【20】。在笔者和Zubair M Ahmed实验室合作的工作于2017年发表后，同年，法国巴斯德研究所的Aziz El‐Amraoui和Christine Petit实验室【21】，以及山东大学的徐志刚实验室和清华大学的熊巍实验室【22】，分别发表论文，证明了结论的一致性，即CIB2蛋白对于听觉信号传导必不可少。
CIB2蛋白虽然对于机械传导至关重要，但其本身似乎并没有足够的弹性和延展性来作为门控弹簧传导机械力。上文已经提到，听觉器官里的毛细胞数量通常很少，人的耳朵里只有16000个毛细胞，小鼠耳朵里更是只有不到3300个毛细胞，且每个毛细胞里的通道蛋白数量也很少，因此如果用小鼠作为模型，在没有遗传学的帮助下，基本很难发现新的门控弹簧候选分子。
因此笔者选择了线虫作为模型，因为线虫的TMC和CIB基因与他们在哺乳动物听觉系统里的同源基因在功能上很相似，都参与机械感受，且在线虫身体里不仅表达在触觉神经元里，而且也表达在肌肉里，蛋白表达量较高，利于表达纯化。
通过与佐治亚理工学院的Hang Lu实验室以及美国德州技术大学的Siva A. Vanapalli实验室的合作，我们利用微流控芯片来控制机械刺激并监测肌肉细胞的机械敏感反应，以及测量虫子爬行时的肌肉强度，我们证明TMC-CIB蛋白复合物不仅在机械敏感神经元里，在肌肉细胞里也同样可以作为机械力的分子感受器。
接下来笔者利用蛋白质组学筛选发现了一种能特异结合CIB蛋白的分子，ankyrin。Ankyrin分子因其富含ankyrin repeats序列而得名，通常作为锚定分子辅助各类膜蛋白在细胞内的特殊定位。有一类只存在于低等生物中的机械敏感离子通道TRPN，其胞内N端也包含大量（29个）的ankyrin repeats序列。
2013年，当时还在加州大学旧金山分校詹裕农实验室的闫致强博士（上文提过现作为独立PI就职于复旦大学）和张伟博士（现作为独立PI就职于清华大学），证明果蝇的TRPN——NompC——通道具备机械敏感性【23】，两年后张伟博士证明N端ankyrin repeats可以作为分子弹簧向NompC通道传递机械力【24】。2017年，詹裕农实验室又和程亦凡实验室合作解析了NompC的冷冻电镜结构【25】。从结构上看，四个NompC亚基的N端ankyrin repeats就像水母的触须一样，悬挂在通道的跨膜区下面，并交缠成一束螺旋弹簧。这个结构非常漂亮，2017年的诺贝尔化学奖颁给了冷冻电镜技术，委员会也选择了这个结构作为冷冻电镜解析的三个范例结构之一（图3中间，另外两个是左边的控制生物钟节律的 KaiCBA 复合物结构和右边的寨卡病毒结构）。
在虫子的神经元和肌肉细胞里，ankyrin分子可以作为细胞内的锚，把机械力传递给TMC蛋白。而在哺乳动物内耳的毛细胞里， TMC通道是否也需要ankrin分子来感知声波机械刺激，目前已知的诸多关键分子，比如TMC1/2，CIB2/3，LHFPL5，TMIE以及tip link是如何形成复合物一起工作，目前都还是未知数。
截止2018年，全世界有4亿6600万人有听力丧失的问题，到2050年，有听力问题的人可能会超过9亿，而目前没有任何药物可以治疗听力丧失，病人只能选择助听器或者人工耳蜗。听觉受体的鉴定虽然基本盖棺落定，不过对于听觉系统如何感知声音的研究可谓方兴未艾，这一研究也有助于我们开发新型疗法来帮助广大有听力问题的群体。
参考文献
1. Buck, L. & Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 65, 175-187, doi:10.1016/0092-8674(91)90418-x (1991).
2. Sengupta, P., Chou, J. H. & Bargmann, C. I. odr-10 encodes a seven transmembrane domain olfactory receptor required for responses to the odorant diacetyl. Cell 84, 899-909, doi:10.1016/s0092-8674(00)81068-5 (1996).
3. Tu, Y. H. et al. An evolutionarily conserved gene family encodes proton-selective ion channels. Science 359, 1047-1050, doi:10.1126/science.aao3264 (2018).
4. Coste, B. et al. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 330, 55-60, doi:10.1126/science.1193270 (2010).
5. Woo, S. H. et al. Piezo2 is required for Merkel-cell mechanotransduction. Nature 509, 622-626, doi:10.1038/nature13251 (2014).
6. Ranade, S. S. et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature 516, 121-125, doi:10.1038/nature13980 (2014).
7. Corey, D. P. et al. TRPA1 is a candidate for the mechanosensitive transduction channel of vertebrate hair cells. Nature 432, 723-730, doi:10.1038/nature03066 (2004).
8. Kurima, K. et al. Dominant and recessive deafness caused by mutations of a novel gene, TMC1, required for cochlear hair-cell function. Nature genetics 30, 277-284, doi:10.1038/ng842 (2002).
9. Vreugde, S. et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature genetics 30, 257-258, doi:10.1038/ng848 (2002).
10. Marcotti, W., Erven, A., Johnson, S. L., Steel, K. P. & Kros, C. J. Tmc1 is necessary for normal functional maturation and survival of inner and outer hair cells in the mouse cochlea. The Journal of physiology 574, 677-698, doi:10.1113/jphysiol.2005.095661 (2006).
11. Kawashima, Y. et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation 121, 4796-4809, doi:10.1172/JCI60405 (2011).
12. Pan, B. et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron 79, 504-515, doi:10.1016/j.neuron.2013.06.019 (2013).
13. Kim, K. X. et al. The role of transmembrane channel-like proteins in the operation of hair cell mechanotransducer channels. The Journal of general physiology 142, 493-505, doi:10.1085/jgp.201311068 (2013).
14. Wu, Z. et al. Mechanosensory hair cells express two molecularly distinct mechanotransduction channels. Nature neuroscience 20, 24-33, doi:10.1038/nn.4449 (2017).
15. Pan, B. et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron 99, 736-753 e736, doi:10.1016/j.neuron.2018.07.033 (2018).
16. Jia, Y. et al. TMC1 and TMC2 Proteins Are Pore-Forming Subunits of Mechanosensitive Ion Channels. Neuron 105, 310-321 e313, doi:10.1016/j.neuron.2019.10.017 (2020).
17. Howard, J. & Hudspeth, A. J. Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84, 3064-3068, doi:10.1073/pnas.84.9.3064 (1987).
18. Howard, J. & Hudspeth, A. J. Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell. Neuron 1, 189-199 (1988).
19. Riazuddin, S. et al. Alterations of the CIB2 calcium- and integrin-binding protein cause Usher syndrome type 1J and nonsyndromic deafness DFNB48. Nature genetics 44, 1265-1271, doi:10.1038/ng.2426 (2012).
20. Giese, A. P. J. et al. CIB2 interacts with TMC1 and TMC2 and is essential for mechanotransduction in auditory hair cells. Nature communications 8, 43, doi:10.1038/s41467-017-00061-1 (2017).
21. Michel, V. et al. CIB2, defective in isolated deafness, is key for auditory hair cell mechanotransduction and survival. EMBO molecular medicine 9, 1711-1731, doi:10.15252/emmm.201708087 (2017).
22. Wang, Y. et al. Loss of CIB2 Causes Profound Hearing Loss and Abolishes Mechanoelectrical Transduction in Mice. Frontiers in molecular neuroscience 10, 401, doi:10.3389/fnmol.2017.00401 (2017).
23. Yan, Z. et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature 493, 221-225, doi:10.1038/nature11685 (2013).
24. Zhang, W. et al. Ankyrin Repeats Convey Force to Gate the NOMPC Mechanotransduction Channel. Cell 162, 1391-1403, doi:10.1016/j.cell.2015.08.024 (2015).
25. Jin, P. et al. Electron cryo-microscopy structure of the mechanotransduction channel NOMPC. Nature 547, 118-122, doi:10.1038/nature22981 (2017).
(可上下滑动查看)