Cell+Science | 骆利群等运用单细胞组学探索高级神经中枢细胞类型-功能关系与小脑核演化模型

撰文 | Qi

责编 | 兮

对神经元类型“真相”的剖析对于理解复杂的神经元回路功能至关重要，单细胞测序技术的发展已使得该领域研究成果呈现出爆发式增长。然而，将转录组数据给定的细胞类型与其他属性，例如发育史、连接模式、电生理特性以及与行为相关的信号编码给定的细胞类型一致化仍具有挑战性。近年来，这个问题已逐步开始得到解决，将scRNA-seq技术应用于细胞类型和功能已知的系统中能达成相对精准的映射，而不同神经元类型和脑区之间的神经元分子和功能特性的匹配程度却大相径庭。

哺乳动物的前额叶皮质（prefrontal cortex, PFC）在感知和行动转化之间发挥关键作用，并作为奖赏导向的决策制定和行为灵活性等认知过程的基础。虽然传统的系统神经科学技术已经证明了复杂的任务相关信号是如何在单个神经元和群体水平上编码的，但这些研究通常忽略了细胞类型和投射模式。为此，最近一些小鼠实验表明mPFC-NAc（nucleus accumbens，伏隔核）神经元在奖赏寻求的约束行为以及奖赏预测线索的表征方面具有不同作用；此外，mPFC-PAG（periaqueductal gray，中脑导水管周围灰质）神经元是多巴胺调节厌恶刺激编码的关键节点。由于这些细胞群体中未知的分子异质性和行为任务的多样性，匹配细胞类型和功能仍是一个持续的挑战【1,2】。

2020年12月17日，来自美国斯坦福大学的骆利群课题组和Stephen R. Quake课题组在Cell杂志上合作发表了一篇题为“Differential encoding in prefrontal cortex projection neuron classes across cognitive tasks”的文章，在这项研究中，作者研究特定转录类型的小鼠PFC神经元与轴突投射和编码特性在多个认知任务中的关系，提出大多数神经元类型靶向多个靶点投射，且大多数靶点接受多种类型神经元的投射。此外，通过在自由活动的小鼠中进行“二选一”任务测试的钙离子成像来评估这些神经元中存在的任务相关信号的多样性。

为了确定转录组类型并揭示PFC区域基因表达的潜在差异，作者对背内侧区（dmPFC）、腹内侧区（vmPFC）和眶额区（OFC）进行分析。首先，作者将Rbp4Cre与在Cre+细胞中表达tdTomato的报告小鼠杂交，双转基因后代从出生后第34天到第40天间分离组织，并使用SMART-Seq2对tdTomato+细胞进行荧光激活细胞分类（FACS）和基于平板（plate-based）的scRNA-seq，共分析了来自三个区域的3139个细胞的。随后，作者使用基于杂交链式反应的荧光原位杂交（hybridization chain reaction-based fluorescence in situ hybridization, HCR-FISH）检查了PFC转录组类型之间标记表达的空间位置和共定位情况，发现dmPFC和vmPFC的转录组和空间组织相似，区分OFC的主要区别在于Pld5和Cxcr7（5-2）簇细胞的富集。需要注意的是，考虑到（1）vmPFC符合啮齿动物中基于丘脑内侧的密集神经支配的PFC的传统定义；以及（2）vmPFC中细胞类型的多样性在给定空间中显示出更紧凑的表现，使得追踪和成像研究更加明确，因此在这项研究的剩余部分作者仅关注vmPFC区域。

为了研究vmPFC投射神经元的转录组类型与特定靶点之间的关系，作者对小鼠注射逆行Cre表达病毒，通过解剖含有逆行标记tdTomato+细胞的vmPFC并执行scRNA-seq后发现，大多数投射定义的细胞群体由多种转录组组成，且每个转录组类型共同投射到多个目标。举例而言，97%以上的vmPFC®PAG神经元映射到Npr3簇，虽然将这些群体称为“PAG投射”，但要注意的是，PAG并非唯一靶点，即vmPFC®PAG神经元会将侧支延伸到多个皮质下靶点。紧接着，作者对PAG或cPFC投射的tdTomato+神经元进行切片染色，以验证上述部分观察结果。结果显示cPFC投射神经元与标记物Cd44、Cxcr7和Figf而不与Npr3共同标记，比例与测序数据中基本一致，与此相反，PAG投射神经元与Npr3而非Figf高频率共同标记。因此，这部分研究分别通过转录组和投射信号分析了不同的神经元群体。

接下来，作者试图通过成像单个细胞水平的神经活动来探索不同的vmPFC细胞类型如何对决策制定的核心功能做出贡献。为此，作者对自由活动的小鼠实施“二选一（two-alternative forced choice, 2AFC）”任务（见图1），小鼠被训练在中心端口区分两个气味提示，通过移至正确端口获取4μl水奖励，反之错误的提示结果关联则会导致短暂的吹气处罚。作者通过光遗传激活皮层抑制神经元的使特定皮层区域沉默的有效策略测试vmPFC的神经活动对任务表现是否重要。作者在所有皮层GABA能抑制神经元中均表达ChR2的Gad2Cre；Ai32双转基因小鼠的vmPFC上方植入双侧光纤套管，结果显示vmPFC对于2AFC任务的正确执行是必需的。

图1，对行动自由的小鼠实施2AFC任务示意图

那么不同类型的vmPFC投射神经元如何编码任务相关信号呢？作者将上述试验任务定义为四个阶段分别是“Approach-Decision-Lick-Reward”，通过在Cre依赖的GCaMP6f小鼠中实施钙离子成像以量化不同任务阶段所有成像细胞的比例。结果显示60%-80%的细胞都至少在一个阶段活性增高，例如与cPFC投射神经元相比，PAG投射神经元和Rbp4Cre标记的类别在“Decision”阶段活化的细胞比例更高；相反，与Rbp4Cre相比，PAG和cPFC投射神经元在“Reward”阶段活化的细胞比例较低。值得注意的是，许多vmPFC细胞不仅对任务阶段表现出活动选择性，而且对左或右的方向也有选择性，而对于方向选择性PAG投射神经元中包含大多数特定于选择方向的信息。

最后，作者在原有试验的基础上做出改动，小鼠需要辨别出四种可能气味以正确获取奖励，随后会切换到无气味提示任务，这也是本研究的关键特征，即对跨多个任务的行为编码的探究。作者发现PAG投射神经元主要代表编码气味提示任务中的选择性，但在切换到无提示任务时小鼠会花费数十秒迅速适应，而cPFC投射神经元则主要代表奖赏环境。这提示不同的细胞类型如何在不同的任务中发挥作用，并强调了在测试特定于细胞类型的编码时具有多样化的行为库的重要性。

总的来说，这项工作通过scRNA-seq数据驱动对认知任务中编码特性的分析，弥合了分子和系统神经科学间的重要鸿沟，进一步加深对PFC功能的理解，并推断了任务信息如何在细胞类型框架中组织的原理。

另外，两支团队于12月18日在Science杂志上发表一项令人瞩目的研究成果——“Cerebellar nuclei evolved by repeatedly duplicating a conserved cell-type set”。在这项工作中，作者以小脑的输出结构“小脑核（cerebellar nuclei）”为模型系统，在细胞类型分辨率水平上研究脑区进化。具体而言，作者通过对鸡，小鼠和人类执行snRNA-seq，STARmap空间转录组分析以及全中枢神经系统投射追踪，确定了一组包含两个区域特异性兴奋性神经元类别和三个区域恒定性抑制性神经元类别的保守细胞类型集合，而该集合能够构成“亚核（subnucleus）”被反复复制以形成新的区域。值得注意的是，在小鼠中负责优先将信息收集并传递至外侧额叶皮质（lateral frontal cortices）的兴奋性神经元类别在大规模扩张的人类外侧核（lateral nucleus）占主导地位，提示在复制原型亚核的框架内，进化会调整不同细胞类型的相对丰度。总而言之，这项研究展示出一个通过整个细胞类型集合的复制和分化而形成的大脑区域进化模型。

来自美国洛克菲勒大学发育神经生物学实验室的Mary E. Hatten教授在同期杂志上对这篇精彩文章作出评价，“传统研究主要集中在小脑皮质，而忽略了小脑的输出结构——小脑核。Kebschull等人利用先前发育研究中鉴定的标记物，为包含内侧核，中间核和外侧核在内的三个小脑核所有神经元提供分子概况，并通过展示小脑核神经元对大脑皮层广泛区域的投射，扩展了我们对小脑核回路的理解。”此外，Mary E. Hatten教授还表示，“这一研究也解决了进化过程中新脑区如何产生的关键问题。小脑核的数量从无腭鱼类中的1个，增加到羊膜动物中的2个和哺乳动物中的3个，而在哺乳动物的三种小脑核中，内侧核是最古老的，外侧核是最年轻的。由于人类外侧核神经元投射到认知区域，因此在外侧核内选择性地扩张B类兴奋性神经元的发现尤其有趣。Kebschull等人对小脑核保守的进化模型的构建及其对小脑与皮质区域广泛联系的探索为我们深入了解小脑回路的活动如何促进语言和高级认知过程打开了大门。”

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.046

https://doi.org/10.1126/science.abd5059

https://doi.org/10.1126/science.abf4483

制版人：琪酱

参考文献

1, Murugan, M.,Jang, H.J., Park, M., Miller, E.M., Cox, J., Taliaferro, J.P., Parker, N.F.,Bhave, V., Hur, H., Liang, Y., et al. (2017). Combined Social and SpatialCoding in a Descending Projection from the Prefrontal Cortex. Cell 171,1663–1677.e1616.

2, VanderWeele, C.M., Siciliano, C.A., Matthews, G.A., Namburi, P., Izadmehr, E.M.,Espinel, I.C., Nieh, E.H., Schut, E.H.S., Padilla-Coreano, N., Burgos-Robles,A., et al. (2018). Dopamine enhances signal-to-noise ratio in corticalbrainstemencoding of aversive stimuli. Nature 563, 397–401.