Sci Adv丨深度学习超高分辨率成像发现溶酶体对内质网调控作用

责编 | 酶美

卷积神经网络（Convolutional Neuron Network ）是计算机视觉领域中的重要架构。深度神经网络通过多层卷积层将输入数据进行拆解与重组，从原始的海量数据中逐步提取深层次的特征和抽象信息。卷积神经网络在医学影像和基因组学等领域已经彰显了其超越传统机器学习的价值。鉴于人工智能、机器学习在生物学研究中发挥越来越重要的作用，BioArt对近年来有代表性的工作做了一番梳理（Nature 亮点| AI助力肿瘤诊断新方法——组织和血液的微生物组学分析；Nature亮点 | 谷歌开发AI系统有望走向临床乳腺癌筛查；Nature Medicine | 超大数据集助力人工智能重新定义病理诊断；特别评述 | 人工智助力药物研发：深度学习预测药物调控激酶谱；DeepScreening：基于深度学习的药物虚拟筛选系统；Nat Biomed Eng | 刘奕志/林浩添团队首创婴幼儿视功能人工智能评估技术；Nat Machine Intelligence | 孙红哲/王俊文合作开发深度学习方法预测联系疾病的金属蛋白结合位点突变）。

日前，剑桥大学的Clemens Kaminski研究组（第一作者为卢萌博士）在Science Advances杂志上发表了题为“The structure and global distribution of the endoplasmic reticulum network are actively regulated by lysosomes ”的研究论文。 该研究基于超高分辨率活细胞动态成像和细胞器光遗传学等分子手段，构建了识别内质网不同特征结构的卷积神经网络，进行自动化（automatic），无偏倚（non-biased）和快速批量的模式识别，分析并统计内质网在不同状态下的结构特征和胞内分布，发现了溶酶体对内质网结构实时动态调控的动力学基础，解析了细胞器相互运动的因果性机制。这个工作综合了超高分辨率成像，细胞生物学和深度学习的前沿技术，实现了基于超分辨成像的大规模图像处理和数据分析，从而发现了新的多细胞器作用机制。

胞内细胞器实时发生快速的结构和分布变化。这些结构和分布的改变，既受到细胞内部环境的调控，也作为调控手段去影响细胞内环境，执行复杂的细胞功能。内质网是胞内最大的细胞器，延伸至胞内每一个角落，形成一张由片状的粗面内质网和管状的光面内质网所构成的网络。内质网是蛋白质生产工厂，绝大多数蛋白质的合成和修饰都发生在内质网上，是维持蛋白质稳态的重要一环；内质网也是胞内钙离子的存储器，与几乎所有其他细胞器都有结构上的接合，调控各细胞器和胞内整体的钙离子稳态。
内质网这张由片状和管状结构共同构成的膜系统持续不断地进行快速和剧烈的结构变化，最为突出的是管状结构的延伸与收缩，而这能直接决定内质网的空间分布和结构形态，如片状和管状结构之间的比例等，从而影响内质网的功能。内质网占有超过50%的胞内膜结构，其大范围的快速形变必定受到精确而有力的调控，有深刻的动力学基础和生理学意义。

对内质网结构的研究由来已久，而随着光学显微技术标记方法的发展，人们可以对活细胞进行动态成像，观察内质网的形态和分布在时间和空间上的变化。1988年， 哈佛大学的陈良博和Christopher Lee利用宽场显微镜观察到了内质网的结构变化，并发现了溶酶体和内质网管状结构的协同运动【1】。之后这一现象被不同研究组多次观察到，成像质量也随着技术的发展逐步提升，因而这种协同运动也被广泛认为是内质网运动的主要方式之一，其他的运动方式包括1）管状结构直接结合马达蛋白沿微管组织滑动（sliding），2）管状结构结合微管组织前端进行的协同运动（TAC）。2018年，中科院生物物理所李栋课题组和Janelia 研究所的Eric Bezig, Jannifer Lippincott-Schwartz组利用超高时空分辨率成像研究胞内多种细胞器的快速运动和相互作用，其中统计了各种运动方式对内质网管状结构延伸的贡献，发现在其所有运动中，35%的管状结构延伸次数与溶酶体的协同运动有关【2】(详见BioArt报道：Cell突破|李栋组开发新型超分辨成像技术揭示细胞器互作新现象——专家解读点评)。

由于内质网和溶酶体都可以直接结合马达蛋白运动，而这便引申出了重要问题：在内质网和溶酶体的协同作用中，谁是动力基础？这一协同作用仅仅存在于内质网局部还是对其整体的结构特征和分布都有作用？更深入的是，这一协同作用的生理学意义是什么？带着这一系列问题，Kaminski研究组首先进行了基于超高分辨率成像的统计分析，发现溶酶体的协同作用贡献了73%的管状结构延伸长度（对应31%的延伸次数，与之前的研究一致）。在没有溶酶体参与时，多数管状结构的伸长经常“后继乏力”，在还未结合到其他内质网前就收缩了回去。

图1. 左图：内质网（紫红色）和溶酶体（绿色）的超高分辨率成像。右图：内质网在45秒内的动态叠加图（颜色标记成像时间点），黑色部分为不同颜色重叠，即稳定不动的内质网结构。

在进一步的机理研究中，为了减弱内质网和溶酶体的锚定强度，作者过表达变异蛋白VAPA(KD/MD), 并观察到随着两者的分离，溶酶体有一个显著的加速运动，而内质网立刻收缩了回去，初步证明了溶酶体为协同运动的动力源。为了更准确全面地解析其动力基础，研究利用细胞器光遗传技术，快速诱发全细胞的溶酶体进行顺行运动（anterograde motion）, 与此同时，观察到内质网管状结构随之快速地铺展到细胞边缘，多通道成像观察到新的管状网络完全由溶酶体的定向运动拉伸而形成。在4分钟的调控过程中，内质网网络如瀑布一般随溶酶体飞喷而出，令人想起“飞流直下三千尺，疑是银河落九天”。由此，研究证实了溶酶体运动对内质网动态结构和其胞内时空分布的因果性调控作用。

图2. 在光遗传诱导的溶酶体（红色）顺行运动（anterograde）中，内质网（白色）被溶酶体（红色）拉伸而向细胞外围迅速扩展。

溶酶体不仅是胞内主要的回收站（recycling），而且也是最重要的信号感受器之一。其时空分布既受到细胞营养状态的精确调控，同时也诱发信号通路对胞内环境的变化做回应，维持细胞稳态。这一功能和内质网有本质上的关联。在解析了两者间的协同作用对内质网形态调控的因果关系后，作者更进一步探究其背后的生理学意义。研究在细胞内尝试了四种分别能调控溶酶体时空分布的营养状态，发现随着溶酶体的分布变化，内质网管状结构也随之延伸或收缩，进而改变管状和片状结构的分布和比例。因此，这一溶酶体引导的内质网结构变化和时空分布具有显著的生理学基础。更进一步，作者将结果扩展到神经元，发现在生长的轴突上，减弱溶酶体对内质网的锚定和拉伸作用，影响轴突生长，使其变短变少。而超分辨成像显示溶酶体结合管状内质网后进行拉伸运动，将断损的内质网快速融合起来，保持轴突内质网的结构连续性; 而在内质网和溶酶体锚定作用减弱的神经元中，轴突内质网出现了大量断损片段。而这验证了溶酶体对内质网调控作用在非极化和极化细胞中都普遍存在，尤其是对神经轴突的生成有重要作用。

这项研究从既有的观察中出发，深入解析了溶酶体对内质网快速形变和分布变化的全面而精确的调控作用，发现了两者协同运动的动力学基础和生理学意义。而在神经发育方面的延伸工作，也为接下来多细胞器相互作用在神经生长和退行性病中的作用提供了新的方向和基础。

图3.神经元轴突内溶酶体（绿色）拉伸内质网（紫红色）向前运动，从而将两段断开的内质网连接起来。

展望和畅想

超高分辨率动态成像在近几年越来越普遍地应用到生物学研究中。但其中一大难点是如何从图像中获得高质量，可靠的分析结果。这首先需要大规模成像，获得海量的原始图像，更需要一系列精准的模式识别工具，执行高通量，快速，无偏倚，全自动化的图像识别和分析统计，将图像输入转化为具有统计学意义的数字输出。这需要细胞生物学，超分辨成像和深度学习三者的无缝结合，并可能产生一个新的领域——智能成像。此论文作为这一结合领域早期的探索工作，研究了三者融合的可能性和难点，也展示了三者融合的巨大前景。在成像的时间尺度上，无标记成像在近两年有突破性进展，北京大学陈良怡组和施可斌组合作揭示细胞器相互作用的动态全景图，使长期无损成像变成了可能【3】（详见BioArt报道：眼见为实|陈良怡/施可彬合作实现对细胞内细胞器相互作用过程的高速三维全景成像，揭示细胞器互作全景图和新细胞器）。因此我们可以预期，无标记成像和超分辨的结合，再利用深度学习进行海量图像分析，识别出内质网，细胞核，高尔基体，溶酶体等一些列细胞结构，并自动化提取其形变，运动和分布的规律，将在前所未有的时间尺度上解析胞内动态过程，研究多种结构的相互作用提供最有力的支撑。而在成像的空间尺度上，最有代表性的前沿工作便是清华大学戴琼海团队在2019年研制出RUSH（实时超大视场高分辨率显微镜），在清醒小鼠的全脑皮层进行宽场动态成像，记录脑动态网络结构，神经血管耦合等生理病理过程【4】。可以预期，当深度学习与RUSH所代表的的超大视场成像相结合，进行全自动化分析与模式识别后，将有可能利用深度神经网络提取出调控行为的全脑神经信号的动态特征，如果再与光/化学遗传学相结合就可以解析环路与行为的因果机制，另一方面，如与超高分辨率成像结合，便可定点观察局部神经元的胞内结构变化，解析神经环路重要节点的细胞生物学基础。

论文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/51/abc7209
排版人：SY

参考文献

1. C. Lee, and B. C. Lan, Dynamic behavior of endoplasmic reticulum in living cells. Cell. 54.1: 37-46 (1988).2. Y. Guo, et al. Visualizing intracellular organelle and cytoskeletal interactions at nanoscale resolution on millisecond timescales. Cell. 15, 175(5), 1430-42 (2018).3. Dong, Dashan, et al. "Super-resolution fluorescence-assisted diffraction computational tomography reveals the three-dimensional landscape of the cellular organelle interactome." Light: Science & Applications 9.1 (2020): 1-15.4. Fan, Jingtao, et al. "Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution." Nature Photonics 13.11 (2019): 809-816