Cell Stem Cell丨CRISPRa助力提高神经元重编程速度和效率

撰文 | Qi责编 | Yan

利用神经元再生来治疗神经退行性疾病仍是再生医学领域的关键挑战，局部神经胶质细胞直接转化为神经元已成为替代功能性神经元的可行选择【1,2】。考虑到活性氧生成的增加会显著的阻碍胶质细胞向神经元转化的过程，同时，神经元依赖于氧化磷酸化（Oxphos），由此可见在神经元转化过程中线粒体活性的重要性，可能需要特定的线粒体蛋白来实现特定于细胞类型的代谢需求【3,4】。然而，在神经元重编程过程中线粒体如何适应新的命运仍不清楚。
近日，来自德国路德维希-马克西米利安大学的Magdalena Gtöz课题组在Cell Stem Cell杂志上发表了一篇题为 “CRISPR-Mediated Induction of Neuron-Enriched Mitochondrial Proteins Boosts Direct Glia-to-Neuron Conversion”的文章，在这项研究中，作者评估了培养的神经元和星形胶质细胞的线粒体组成的相似性和差异性，旨在通过CRISPRa（clustered regularly interspaced short palindromic repeat activation）介导的转录工程来调节各自的基因来改善重编程过程中的错配问题，早期dCas9介导的编码线粒体蛋白基因的激活可以显着提高胶质细胞-神经元的转化效率以及神经元存活率，特别是对于富集于神经元而非星形胶质细胞的抗氧化剂蛋白，表明线粒体蛋白在命运转化过程中发挥驱动作用。

首先，作者分离出生后第五天的小鼠皮层星形胶质细胞，转导携带编码线粒体靶向的绿色荧光蛋白，以及携带（或不携带）先前被证明可将星形胶质细胞转化为GABA能神经元的重编程前体因子的逆转录病毒（Ascl1- ires-mitoGFP）【5】，以监测重编程过程中线粒体的形态变化。可以观察到成功转化的神经元细胞中线粒体体积小，形态短且圆，与高分裂特性一致；相反，星形胶质细胞具有更长的线粒体形态和更强的融合特性（见下图1）。

图1，左：星形胶质细胞（线粒体由mitoGFP标记）；中：Asc1-非重编程星形胶质细胞；右：Asc1-诱导的神经元的线粒体形态图像

那么，是什么原因引起这种差异呢？作者使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）来鉴定神经元和星形细胞线粒体中的蛋白质。在星形胶质细胞和神经元中分别检测到757和738种线粒体蛋白，其中特异的富集于星形胶质细胞中的为164个（22％），而富集于神经元中的为141个（19％），由此可见，这些细胞类型之间约有五分之一的线粒体蛋白质组显著不同。GO分析提示诸如脂肪酸分解代谢途径在星形胶质细胞中富集，作者接下来想知道这一途径是否与重编程有直接功能相关性。在转化早期，使用脂肪酸β氧化的关键调节剂抑制剂阻断该途径，与对照相比显著改善了重编程转化率。而对于富集于神经元的线粒体蛋白而言，GO分析提示重要通路与RNA代谢和功能有关，进一步凸显先前提出的这样一种观点，即tRNA生物发生是神经元线粒体中的重要活动，其功能障碍与神经发育疾病有关【6】。
接下来，为了确定星形胶质细胞是否以及何时下调其特征性线粒体蛋白，以及如何在转化为神经元的过程中增加富集于神经元的线粒体蛋白表达，作者选择了可通过免疫染色检测到的差异富集的功能相关候选蛋白，并发现在Advl1介导的重编程过程中，富集于星形胶质细胞（Sfxn5和Cpox）或神经元（Prdx2和Gls）的线粒体蛋白变化相对较晚。值得注意的是，这些变化与转化的程度相关，提示了这些蛋白可能存在功能相关性的假设。
最后，为了验证上述假设，作者选择了8种富集于神经元线粒体的候选物，转染dCas9-VPR编码质粒和非靶向对照gRNA或靶向启动子区域的gRNA48小时后，FACS分选的细胞qRT-PCR结果显示候选物显示出不同的诱导水平。将所选候选物的gRNA克隆到具有GFP报告模块的质粒中后，对来自转基因小鼠品系的星形胶质细胞进行原代培养，结果这些产物都加速了胶质细胞向神经元的转化，值得注意的是，它们还增加了神经元的的轴突及树突的复杂程度；上述结果表明神经元特异性的线粒体蛋白在胶质细胞向神经元的转化过程中尤其重要，它们的早期诱导和高表达可以改善重编程。紧接着，作者通过对单个细胞进行实时成像证实这些富集于神经元的线粒体蛋白（Prdx, Sod1），不仅可以加快转化进程还能保护神经元免于凋亡。

图2，CRISPRa介导的神经元富集的线粒体编码基因的早期诱导提高了神经元重编程的速度和效率

总的来说，这项研究解析了皮质星形胶质细胞和神经元的线粒体蛋白质组，星形胶质细胞特异性线粒体蛋白通常在星形胶质细胞-神经元直接重编程过程中仅部分下调，而特定于神经元的线粒体蛋白则上调较晚，因此，通过CRISPRa介导的神经元富集的线粒体编码基因的早期诱导可以提高直接神经元重编程的速度和效率，重要的是，为细胞类型特异性线粒体蛋白的功能研究提供了新思路。

原文链接https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.10.015

制版人：琪酱

参考文献

1, Barker, R.A., Go ¨ tz, M., and Parmar, M. (2018). New approaches forbrain repair-from rescue to reprogramming. Nature 557, 329–334.2, Vignoles, R., Lentini, C., d’Orange, M., and Heinrich, C. (2019). DirectLineage Reprogramming for Brain Repair: Breakthroughs and Challenges. TrendsMol. Med. 25, 897–914.3, Harris, J.J., Jolivet, R., and Attwell, D. (2012). Synaptic energy useand supply. Neuron 75, 762–777.4, Calvo, S.E., and Mootha, V.K. (2010). The mitochondrial proteome andhuman disease. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 11, 25–44.5, Heinrich, C., Blum, R., Gasco ´ n, S., Masserdotti, G., Tripathi, P., Sa´ nchez, R., Tiedt, S., Schroeder, T., Go ¨ tz, M., and Berninger, B. (2010).Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functionalneurons. PLoS Biol. 8, e1000373.6, Schaffer, A.E., Pinkard, O., and Coller, J.M. (2019). tRNA Metabolismand Neurodevelopmental Disorders. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 20, 359–387.