Sci Adv | 周严/吴旻团队合作揭示了SETD2在大脑皮层图式形成和自闭症样行为中的作用和分子机制
责编 | 酶美
哺乳动物大脑新皮层主要由6层投射神经元构成，是自然界最为复杂的结构，其在切向维度上具有四个重要功能区域：初级运动皮层（primary motor cortex, M1）、初级躯体感觉皮层（primary somatosensory cortex, S1）、初级视觉皮层（primary visual cortex, V1）和初级听觉皮层（primary auditory cortex, A1），行使认知、自主运动和感觉功能。功能区域的形成和特化过程被称为图式形成（arealization），图式形成缺陷与神经系统发育疾病密切相关。自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一种神经发育疾病，核心特征为社交和语言障碍、刻板或重复行为。神经解剖学和影像学相关研究发现相当比例ASD患儿的大脑额叶皮层区域面积增大【1】。类Sotos综合征是一种过度生长疾病，临床上表现为智力障碍、语言迟缓、巨头症、先天性面部畸形以及自闭症【2,3】。SETD2基因编码催化组蛋白3第36位赖氨酸3甲基化（H3K36me3）的甲基转移酶，其在部分ASD患者和类Sotos综合征患者中发生功能失活突变。然而，对SETD2在大脑皮层发育、社会行为以及类Sotos综合征发病中的作用与相关机制仍不清楚。
2021年1月1日，武汉大学免疫与代谢前沿科学中心周严团队和吴旻团队合作在Science Advances上发表了题为Abnormal neocortex arealization and Sotos-like syndrome-associated behavior in Setd2 mutant mice的研究论文。在这项研究中，作者发现在小鼠大脑皮层特异敲除Setd2导致大脑皮层图式形成和皮层-丘脑投射建立缺陷。SETD2功能缺失小鼠具有社交障碍、空间记忆和运动学习能力下降等异常行为，模拟了类Sotos综合征和自闭症患者的部分临床表型。分子机制上SETD2以依赖H3K36me3甲基转移酶的方式维持成簇原钙粘蛋白基因（clustered Protocadherins, cPcdh）的表达。这一发现为深入理解大脑皮层图示形成、类Sotos综合征和自闭症的发病机理提供了新的思路。
作者探索了SETD2在小鼠社交行为、运动学习记忆和空间探索中的功能。构建了在大脑皮层前体细胞中敲除Setd2的Setd2Emx1-cKO小鼠，发现Setd2Emx1-cKO小鼠在旷场实验中探索能力下降；在三箱社会交互实验中具有显著的社会交互障碍；在水迷宫实验中表现为空间记忆和学习能力下降；在疲劳转棒实验中具有运动学习能力减弱表现。这些表型模拟了类Sotos综合征和自闭症患者的部分表型（例如智力障碍和社交障碍）。
图1. SETD2功能缺失导致小鼠出现社交障碍、运动学习能力和记忆能力下降等异常行为
为了研究Setd2在小鼠大脑皮层图式形成中的功能，作者通过切片和整体原位杂交染色分析了新生（P0）小鼠和出生后第7天（P7）小鼠大脑皮层中区域特异标志分子（Lmo4、Epha7、Rorβ、Cad8）的表达，发现运动区域和体感区域标志分子的表达量与表达范围发生了明显改变。为了精确研究小鼠大脑皮层各功能区域的变化，作者应用免疫组织化学染色分析了感觉区域（S1、V1、A1）特异标志分子5-HT的表达，发现在Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中，运动区域向后侧延展，体感区域向内侧和后侧移位，视觉区域向后侧压缩，前-后侧桶状皮层（antero-lateral barrel subfield, ALBSF）几乎消失。以上结果表明Setd2影响神经元的分子特性，对于小鼠大脑皮层图式形成的正确发生至关重要。
图2. SETD2功能缺失导致小鼠大脑皮层图式形成过程受损
随后，作者分析了P7 Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中浅层神经元（SATB2+、CUX1+）和深层神经元（CTIP2+、FOXP2+）的分布，发现神经元的层次命运决定没有发生改变，但是外侧浅层神经元的排列却出现异常。BrdU标记实验和TBR2免疫荧光染色结果显示，SETD2缺失不影响小鼠大脑皮层神经前体细胞自我更新和中间前体细胞的发生。
由于大脑皮层图式形成（功能分区）异常能导致重要神经环路的改变，作者进一步应用顺行示踪腺相关病毒开展了皮层-丘脑-皮层环路的示踪研究。在正常小鼠中，M1和S1分别接收来自丘脑腹外侧核（ventrolateral nucleus, VL）和腹后侧核（ventroposterior nucleus, VP）的丘脑-皮层轴突输入，这些轴突输入终止于第IV层神经元。同时，M1和S1的第VI层神经元也发出终止于对应丘脑核团的皮层-丘脑轴突输出。然而在Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中，丘脑-皮层纤维束广泛分布于第II-VI层；皮层-丘脑纤维束无法正常投射到对应的丘脑核团，而是混合重叠在内囊区域。表明在Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中，运动区域和感觉区域的神经元分子特性发生了改变，皮层-丘脑-皮层环路无法正确形成。
图3. Setd2调控皮层-丘脑-皮层环路的形成
为阐明Setd2敲除导致小鼠出现图式形成异常、皮层-丘脑-皮层环路改变及类Sotos综合征和自闭症行为的分子机制，作者应用转录组测序发现成簇原钙粘蛋白基因（cPcdh）在E13.5天Setd2Emx1-cKO小鼠大脑皮层中的表达水平显著下降，而且cPcdh杂合敲除小鼠（Pcdhαβγ+/-）表现出与Setd2Emx1-cKO小鼠类似的图式形成缺陷。H3K36me3的 ChIP-seq表明H3K36me3修饰在Setd2Emx1-cKO小鼠皮层cPcdh的部分增强子区域明显减弱，而这种修饰的改变会导致DNA甲基转移酶DNMT3A/B（特别是DNMT3B）在这些增强子区域的结合增加。
最后，作者构建了类Sotos综合征患者具有的SETD2点突变体（SETD2L1815W）。应用敲除SETD2的细胞开展回复实验发现，该点突变能使SETD2失去催化H3K36me3修饰的活性。子宫电穿孔实验表明cPcdh在皮层投射神经元的表达依赖于SETD2的H3K36me3甲基转移酶功能。
图4. cPcdh的表达依赖于SETD2的H3K36me3催化活性
总之，作者首次系统揭示了SETD2及其介导的H3K36me3修饰在大脑皮层发育、特别是图式形成中的作用，发现表观遗传修饰在大脑皮层图式形成中具有重要功能，更为深入理解类Sotos综合征和自闭症的发病机理提供了新的思路和动物模型支撑。
图5. 机制模型
无独有偶，近期其他课题组的工作也发现组蛋白修饰在神经系统图式形成中具有重要功能。RING1A/B是多梳阻遏复合物1（PRC1）的核心组分，催化H2AK119ub修饰，MLL1是H3K4甲基转移酶，两者都在小鼠大脑背-腹特性的建立中发挥关键作用【4,5】。
本论文第一作者为武汉大学生命科学学院博士研究生徐立超，疫情期间徐立超一直留守武大校园开展科研工作；武汉大学医学研究院/免疫与代谢前沿科学中心周严教授、武汉大学生命科学学院/免疫与代谢前沿科学中心吴旻教授为该论文的共同通讯作者；中科院物数所徐富强教授、天津医科大学吴旭东教授等对该工作有重要贡献。
原文链接：
https://advances.sciencemag.org/content/7/1/eaba1180
参考文献
1.Courchesne, E., et al., The ASD Living Biology: from cell proliferation to clinical phenotype. Molecular Psychiatry, 2019. 24(1): p. 88-107.
2.Luscan, A., et al., Mutations in SETD2 cause a novel overgrowth condition. J Med Genet, 2014. 51(8): p. 512-7.
3.van Rij, M.C., et al., Two novel cases expanding the phenotype of SETD2-related overgrowth syndrome. Am J Med Genet A, 2018. 176(5): p. 1212-1215.
4.Eto, H., et al., The Polycomb group protein Ring1 regulates dorsoventral patterning of the mouse telencephalon. Nature Communications, 2020. 11(1).
5.Delgado, R.N., et al., Maintenance of neural stem cell positional identity by mixed-lineage leukemia 1. Science, 2020. 368(6486): p. 48.