专家点评Cell | 破除转录桎梏—E. John Wherry/史俊炜组发现转录层面上的效应T细胞免疫检查点Fli1

点评 | 徐萌（清华大学）、王皞鹏（上海科技大学）

撰文 | 宝叔

责编 | 兮

效应T细胞是对抗感染和肿瘤的核心细胞亚型。因此，如何在慢性感染或者肿瘤发生中增强效应T细胞响应，是T细胞相关免疫疗法的关键所在。免疫检查点抑制剂，诸如PD-1阻断剂等，可以有效的将慢性感染或者肿瘤微环境中的耗竭性T细胞重新激活，使之具有部分效应T细胞特征【1,2】。然而，由于慢性感染或者肿瘤环境会筛选性的促进效应T细胞死亡，介导耗竭性T细胞分化【3】，同时若慢性炎症环境未清除，免疫检查点抑制剂引起的效应T细胞再激活并不具有持久性【2】，因此如何在慢性感染或者肿瘤进展过程中，增强稳定的效应T细胞响应，成为T细胞相关疗法中的一个主要问题。

近期的研究发现多个转录因子，包括c-Jun【4】, Runx3【5】等，可以帮助T细胞在肿瘤微环境中更好的发挥效应功能。另一方面，敲除特定转录因子，诸如TOX【6-10】和NR4A1【11,12】,会介导短期内较强的效应T细胞响应。然而，在转录层面上，领域内仍旧缺失一个如PD-1的，具有高强度抑制效应T细胞扩增或者分化的“刹车机制”。

2021年2月25日，宾夕法尼亚大学的E. John Wherry和史俊炜团队（第一作者为陈则宇博士）于Cell上发表了题为“In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer” 的文章，采用优化的T细胞CRISPR体内筛选体系，鉴定出了转录因子Fli1对于效应T细胞扩增和分化的强烈抑制作用。在不同的体系中，敲除Fli1的抗原特异性CD8 T细胞会获得5-30倍的数量扩增，并且获得更强杀伤性淋巴细胞特征。

研究人员首先建立并且优化了针对抗原特异性T细胞的体内CRISPR筛选体系（命名为“OpTICS”），包括更改了逆转录病毒载体的sgRNA序列，使用单Cas9拷贝的载体细胞进而降低DNA损伤对效应T细胞的影响【13,14】，优化了转染和细胞分选方案等。之后，研究人员结合已有的抗原特异性T细胞在不同阶段的RNA-Seq和ATAC-Seq数据，根据基因表达量筛选出来了120个转录因子，建立了转录因子sgRNA文库。利用OpTICS系统，研究人员鉴定出了在急性和慢性感染模型中，具有阳性筛选特性的多个转录因子，包括Fli1, Smad2, Erg, Nfatc2, Irf2等等。之后研究人员重点关注了转录因子Fli1, 确认了利用OpTICS对该转录因子的敲除效率在80%左右，同时敲除Fli1会导致5-30倍的抗原特异性T细胞扩增。

之后，研究人员在急性感染体系中，鉴定了Fli1敲除的抗原特异性T细胞，会介导效应T细胞分化而在数量上并不影响记忆T细胞分化。同时研究人员发现，Fli1的敲除会明显增加效应T细胞的扩增，但是对细胞的凋亡潜力几乎没有影响。此外，Fli1敲除的细胞虽然没有提高IFNG和TNF等杀伤性细胞因子的分泌潜力，但却获得了更多的穿孔素，颗粒酶的分泌活性，同时增强了细胞毒性作用。

进一步的，研究人员在慢性感染模型中，同样发现Fli1敲除的抗原特异性T细胞会促进效应T细胞的分化,同时抑制耗竭性T细胞前体细胞的产生。转录层面上，Fli1敲除的T细胞也富集了效应T细胞的转录特征。有趣的是，研究人员也发现PD-1和Fli1的表达量之间并不存在明显的上下游关系，提示了Fli1有可能具有独立于PD-1的“刹车机制”。

那么作为一个转录因子，Fli1是如何行使“转录刹车”的功能的呢？研究人员进一步的对于Fli1敲除的T细胞/对照组细胞进行了ATAC-Seq,发现Fli1敲除的细胞大量富集了效应T细胞相关基因的染色体开放区域峰(chromatin accessible peaks)。进一步的, 通过DNA结合域序列分析（DNA binding motif analysis）,研究人员发现Fli1敲除细胞的染色体开放区域中富集了大量ETS:RUNX的DNA结合序列。由于Fli1本身是一个重要的ETS家族的转录因子，那么这个数据提示Fli1对于效应T细胞的功能可能通过RUNX介导。此外，研究人员还进行了Fli1 CUT&RUN实验，并且和ATAC-Seq产生的峰值进行了重叠分析，进一步发现Fli1会直接抑制诸如Cx3cr1, Cd28, Havcr2等效应T细胞相关基因的启动子/增强子的染色体开放度。统计上而言，Fli1结合的染色体区域有78%在Fli1敲除的T细胞内开放，进一步表明了在T细胞中，Fli1主要行使了转录抑制或者染色体封闭的功能。此外，研究者们在对于CUT&RUN中Fli1结合区域附近的DNA结合域序列分析中也发现了RUNX的DNA 结合序列，进一步提示Fli1可能通过影响RUNX来抑制效应T细胞功能。

RUNX家族主要有Runx1,2,3三个主要分子(某些研究中还涉及Runx4)。其中在造血系统中，Runx1已经被证实与Fli1有直接相互作用。研究人员首先发现Runx1过表达会介导效应T细胞的分化抑制，同时Fli1和Runx1可能具有协同作用，过表达Runx1会削弱Fli1敲除细胞效应细胞特性。因此，研究人员将目光锁定到了Runx3上。在Fli1敲除的T细胞里，过表达的Runx3可使Fli1敲除所释放的Runx DNA结合域可以被充分利用，从而进一步的加强Fli1敲除T细胞的效应T细胞表型。

那么Fli1敲除的细胞是否确实会增强体内的T细胞功能呢？研究人员首先用了LCMV-Cl13, 流感病毒（PR8毒株）以及李斯特杆菌模型来测试在感染条件下T细胞对于宿主的保护性。在上述所有模型中，对比对照组, Fli1敲除组的抗原特异性T细胞都具有更好的抗感染功能。进一步的，在感染器官中，研究人员也都检测到了更多的T细胞扩增。进一步的，研究人员利用B16黑色素瘤模型，在Rag2-/-和Cas9受体小鼠上分别证实， Fli1敲除的细胞对比对照组，有更好的抑制肿瘤的功能。此外，研究人员不但在肿瘤微环境中发现Fli1敲除的细胞有更多的细胞和更高比例的肿瘤响应T细胞特征，也在外周淋巴系统（脾脏，淋巴结）中发现了更多的Fli1敲除细胞，进一步的证明了Fli1敲除细胞可能有长期持久的抗肿瘤特性。

综上所述，研究人员通过优化体内的T细胞筛选体系，鉴定出了转录因子Fli1通过抑制Runx3功能从而抑制效应T细胞的核心作用，进一步的证明敲除Fli1会增强T细胞的抗感染效果，为临床上设计具有更强效应T细胞特性的CART提供了生物学原理支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.019

专家点评

徐萌（清华大学医学院免疫所）

研究T细胞分化的轨迹和关键调控节点，理解T细胞命运决定机制，能够帮助我们找到更有效的T细胞治疗策略。其中，CD8 T细胞经过TCR刺激活化后，可以从naïve状态分化成具有杀伤功能的效应T细胞（Teff）。后者在应对病毒感染以及抗肿瘤免疫反应中起到关键作用。然而在慢性感染以及肿瘤微环境中，T细胞分化会向耗竭状态倾斜，失去一部分向Teff细胞分化的能力。如何能尽量多的产生效应T细胞，避免向耗竭型T细胞分化，以更有效的抗感染及抗肿瘤一直是领域内研究的热点。而过去的研究还发现效应T细胞在分化进入终末期后，虽然获得了很强的杀伤能力，但也会失去持续增殖更新的能力。那么，是否有可能找到Teff早期分化过程的关键节点，在该细胞尚有较强增殖能力的时期确立其向效应T细胞分化的命运，并最终获得足够多的效应T细胞？这一机制的探索将有助于解决目前T细胞治疗的瓶颈。

今日推荐的这篇文章，利用了该实验室优化的Crispr-Cas9筛选系统（OpTICS）针对这一问题展开研究。通过对覆盖120个关键转录因子的文库进行体内筛选，研究者发现转录因子Fli1具有抑制Teff细胞分化的功能。在急性感染模型中，Fli1敲除后T细胞增殖能力提高了近10倍，同时偏向于分化形成Teff细胞。值得注意的是，Fli1敲除并没有影响T细胞向记忆型T细胞分化的能力。接着，作者通过ATAC-seq研究Fli1敲除后染色质开放性的变化，发现染色质上多数Fli1结合位点会在该该基因敲除后，从关闭状态转变为开放状态。说明Fli1可以调控染色质的关闭。敲除Fli1后，这些开放区域会进一步被RUNX家族转录因子结合，促进Teff分化相关因子Cx3cr1和Cd28的表达。过表达RUNX3可以进一步增加Teff细胞的数量。最后，回输Fli1缺失的抗原特异性CD8 T细胞的体内实验显示出有效的控制病毒以及肿瘤生长的能力。综上所述，这些数据解释了Fli1通过限制Runx3结合位点的染色质开放性，进而抑制Teff细胞的分化的调控机制；也为T细胞治疗提供了新的干预靶点。

最近针对Naïve T细胞向效应T细胞、记忆T细胞和耗竭T细胞这三者分化轨迹的研究找到了许多关键转录因子。人们不难发现一个规律，干扰一个转录因子以影响T细胞分化命运往往具有排他性的。即促进某一方向分化的同时也牺牲了向其他方向分化的可能。获得更多效应型T细胞的代价很可能是减少了同样非常重要的记忆型T细胞。与之不同的是，Fli1敲除不影响T细胞分化过程的早期命运决定，而是解除了Teff分化进程中对Runx3结合的抑制效应，促使Runx3最大程度发挥功能，在获得大量效应T细胞的同时维持了其它类型T细胞的分化和数量。此外，2017年的一项研究还发现Runx3可以提高T细胞在组织内的驻留能力。结合Fli1的发现，可以展望Fli1用于CarT细胞治疗实体瘤的前景。

王皞鹏（上海科技大学生命科学与技术学院）

作为人体免疫系统的重要组成部分，T细胞在对肿瘤细胞的免疫监控和杀伤中起着至关重要的作用。现有的基于T细胞的肿瘤免疫治疗主要包括：信号检查点抗体阻断，嵌合性抗原受体-T细胞治疗和T细胞过继转移治疗。目前，这些基于T细胞的肿瘤免疫疗法在临床上取得巨大的成功。如嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）技术改造过的T细胞疗法已在B淋巴细胞白血病中产生了显著的疗效。然而纵观整体，T细胞肿瘤免疫治疗的适用面和成功率仍有待大幅度的提高。肿瘤的杀伤是有CD8效应T细胞完成，如何优化和提高效应T细胞抗肿瘤活性成为当前免疫治疗重要的目标。但是，领域内对效应T细胞的分化机制并不清楚。

在最新发表的Cell杂志上，宾夕法尼亚大学Junwei Shi团队与John Wherry实验室合作，利用转录因子聚焦型sgRNA文库，在体内CRISPR筛选了对效应T细胞分化进行了系统性的研究，发现一个全新的负向调节效应T细胞分化的重要转录因子Fli1。他们的研究发现，Fli1缺陷将增强效应T细胞分化。机制上，他们发现Fli1通过限制ETS:RUNX位点的可及性（accessibility），拮抗Runx3的功能从而抑制效应T细胞的分化。

这项研究有以下几个亮点：

1. 建立了一个快速，高效的T细胞体内筛选的平台（OpTICS）。OpTICS平台利用了表达Cas9蛋白的TCR转基因T细胞为供体细胞，结合骨架优化的sgRNA 病毒表达载体，可以针对不同聚焦型文库（例如针对所有激酶的sgRNA文库或者针对所有GPCR的sgRNA文库）进行CRISPR筛选。

2.  通常认为，效应T细胞的分化与记忆T细胞的分化（或者耗竭T细胞的分化）是一个平衡，两者是一个此消彼长的关系。以转录因子TCF1为例，敲除TCF1虽然可以短期内促进效应T细胞的分化，但是长期而言，也会导致记忆T细胞和耗竭性T细胞的数量减少。这对肿瘤免疫应答是不利的，因为机体内肿瘤特异性的记忆T细胞的存在可以有效防止肿瘤复发。该项研究发现敲除转录因子Fli1不仅可以促进效应T细胞的分化，同时不影响记忆T细胞的数量。这项研究证明Fli1是一个T细胞肿瘤免疫治疗潜在的药物靶点。Fli1缺失的TCR-T或者CAR-T治疗的疗效值得进一步探索。

该项研究发现也启发了一些新的思考：（1）关于Fli1的调控效应T细胞的分化的分子机制不是完全清楚。例如，Fli1是如何限制ETS:RUNX位点的可及性? 是否通过与这些位点的相互作用？（2）Fli1除了影响效应T细胞的分化，是否对T细胞其他功能有作用？例如，前期我们针对T细胞激活的调控进行了全基因组筛【15】。我们发现Fli1是排名第一的T细胞激活的正调控因子，说明除了调节T细胞分化，Fli1可能参与了T细胞活化过程中的信号转导。（3） 转录因子可以作为药物的靶点开发小分子抑制剂。领域已成功开发了STAT家族，NF-Kb和Myc的小分子抑制剂， 可否开发Fli1的小分子抑制剂在临床上使用？这些问题的答案有待进一步研究揭晓。

制版人：琪酱

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