Nature | 闫楠团队报道不依赖cGAS的 STING 激活——STING-IRF3信号“启动-增强” C型尼曼匹克氏症

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近期各项前沿研究表明，天然免疫cGAS-STING 信号通路介导多种自身系统性免疫、炎症疾病，其中包括中枢神经系统疾病，如Aicardi-Goutières 综合征 (AGS)，帕金森氏综合症（Parkinson’s Disease, PD），肌萎缩侧索硬化症 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 等【1-5】。在AGS中，由于TREX1/DNaseIII突变导致体内积累大量的基因组DNA，激活cGAS-STING信号通路，诱发婴儿神经炎症及自身系统免疫疾病【2】。在PD及ALS中，大量受损的线粒体释放mt-DNA到胞质中，激活cGAS-STING 信号通路介导神经炎症【3,5】。

经典的STING激活是通过cGAS催化宿主自身DNA 合成2’3’-环状 GMP-AMP (cGAMP)或细菌感染产生的c-di-AMP 和c-di-GMP所诱导激活的。但对于cGAS/cGAMP非依赖型STING 的激活过程以及其在疾病发病机制的研究却很匮乏。近期已发现STING的一些自激活突变体能够在不结合cGAMP的情况下激活，导致一种称为SAVI（STING-associated vasculopathy with onset in infancy）的自体免疫疾病。配体依赖型/非依赖型介导的STING 激活，都会导致STING 从内质网向高尔基体的囊泡运输，同时招募TBK1, 激活IRF3-IFN 通路，最终被溶酶体降解。STING在各个细胞器之间的运输，降解过程精确调节免疫信号的开关，一旦发生问题将会导致癌症，自体免疫等疾病【6】。

为进一步揭示STING 运输过程中在各个细胞器的调控因子，并深入探讨cGAS/cGAMP非依赖型STING 激活的过程以及其在神经炎症发病机制中的功能，2021年7月21日，德克萨斯大学西南医学中心闫楠（Dr. Nan Yan）团队（第一作者为褚婷婷博士）在Nature杂志上发表了题为Tonic Prime-Boost of STING Signaling Mediates Niemann-Pick Disease Type C的文章。

首先，作者利用高分辨率时空特异性近距离标记工具APEX2 (Engineered ascorbic acid peroxidase 2) 融合STING 蛋白进行表达，APEX2 在生物素-苯酚 (BP) 和过氧化氢 (H₂O₂)作用下能实时（在几秒-1分钟内）生物素标记STING 周边纳米范围内的互作蛋白网络【7】。作者利用HT-DNA激活STING，在转运特异时间点标记STING 在不同细胞器上调控蛋白，并通过BFA和Bafilomycin A1分别富集内质网和溶酶体上的辅因子，通过链霉素Pull-down及串联质量标签质谱 TMT-MS全面高分辨率揭示了STING 激活-运输-降解过程中的各细胞器上的蛋白调控网络（图1）。

图1

在筛选到的众多STING辅因子中，作者深入研究溶酶体上的NPC1蛋白对STING的调控作用。作者惊奇地发现，NPC1缺失能在本底水平（非刺激条件下）激活STING，导致大量干扰素刺激的基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）表达。STING敲除能降低NPC1缺陷导致的ISGs升高表达，而cGAS敲除却不能逆转ISGs的表达。并且在Npc1/Sting双敲除MEFs中重组表达WT STING, 或 R232A (破坏cGAMP结合)，或S366A (破坏IFN 信号) 突变体，WT 和R232A 能恢复ISGs表达水平，但S366A却不能。这些结果暗示NPC1缺陷导致本底水平STING的激活不依赖于cGAS/cGAMP。

NPC1缺陷导致溶酶体中积累大量胆固醇和其他脂类，降低胞质中胆固醇含量，内质网感应低浓度胆固醇进而激活SREBP2-SCAP从内质网向高尔基体运输【8】。近期研究表明STING 能与SREBP2-SCAP 复合体相互作用【9】，因此作者提出在NPC1缺陷细胞中，SREBP2的激活转运启动STING “捆绑运输”（tethered trafficking）的假设。为了证明这一假设，作者利用WB, 细胞免疫荧光，qRT-PCR等技术同时验证在NPC1缺陷细胞中，SREBP2被激活，同时p-STING/p-TBK1/p-IRF3，以及ISGs水平都明显升高。而利用2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD，能促进胆固醇从溶酶体排到胞质中，抑制SREBP2激活和转运）处理NPC1缺失细胞，则能逆转STING的激活。Kockdown SREBP2, 能抑制NPC1缺失细胞中STING 的激活，重组WT或转录失活突变的SREBP2都能恢复STING的激活，暗示SREBP2从内质网向高尔基体的转运活性而非转录活性介导STING的激活。作者进一步利用化学药物Triparanol或敲除INSIG1等手段促进SREBP2 转运，发现均能启动STING激活，并且这一过程不依赖于cGAS， 也不依赖于RIG-I/MDA5-MAVS信号通路。

作者进而发现NPC1缺陷减少STING蛋白的降解，并且p-STING/p-TBK1/p-IRF3信号明显延长。为了阐释NPC1能否直接与STING结合，是否作为接头蛋白介导STING在溶酶体的降解？作者通过一系列免疫共沉淀，体外招募溶酶体等实验证明内源STING能与NPC1特异性结合，不能与溶酶体上其他膜蛋白如LAMP1结合。STING利用其N端多重跨膜区域与NPC1 三个多重跨膜束（TM bundle）相结合，其中与TM3-TM8 / TM9-TM13两个跨膜束具有非常强的相互作用。以上结果表明，NPC1可直接与STING结合介导STING的溶酶体降解。

Npc1^-/-小鼠能很好地模拟NPC病人的表型（C型尼曼匹克氏症——NPC是一种遗传、不可逆性然而是可治疗的慢性恶化性脑脊髓交感神经疾病）。为进一步在小鼠水平上验证STING介导Npc1^-/-小鼠的神经炎症，作者通过CRISPR KO技术在BALB/c 背景Npc1^-/-小鼠的基础上敲除Sting（因Sting1与Npc1基因同在小鼠18号染色体上，只隔24MB）。STING敲除能够明显增加Npc1^-/-小鼠的体重，改善运动功能（降低小脑性共济失调综合评分），降低小脑及BMDMs中ISGs，炎症因子的表达。Npc1^-/-Sting^-/-小脑IHC染色表明减少浦肯野神经元丢失，抑制小胶质细胞激活。作者进一步将C57BL/6J Npc1^-/-小鼠分别与C57BL/6J Irf3-/- 或cGas^-/-小鼠进行杂交，意外地发现只有Npc1^-/-Irf3^-/- 能与Npc1^-/-Sting^-/-鼠一样，改善Npc1^-/-各种表型。但是Npc1^-/-cGas^-/-小鼠却不能改善Npc1^-/-小鼠的任何表型，甚至还会增强发病过程。这些结果从遗传学角度，进一步表明STING介导Npc1^-/-小鼠的神经炎症不依赖于cGAS（图2）。

图2

作者还同时比较了NPC1 和NPC2 模型，NPC2 缺失同样导致胆固醇大量积累在溶酶体中，可以激活SREBP2进而启动STING的转运激活。但在NPC2模型中，NPC1蛋白是正常的，不会影响STING的降解，所以看到NPC2模型中神经炎症表型要轻于NPC1。因此作者认为，STING 介导NPC1的神经炎症是“启动”和“增强”两个不可或缺的步骤共同导致的。

综上，该文章鉴定了溶酶体膜蛋白NPC1为 STING 运输-降解辅因子。NPC1 与 STING 相互作用并将其招募到溶酶体进行降解。NPC1 缺失导致STING 与SREBP2 的“捆绑运输“来“启动”STING 信号，并通过阻断溶酶体降解来“增强”STING 信号。Npc1^-/-小鼠严重的神经系统疾病需要“启动“和“增强” STING 信号。Sting 或 Irf3（而非 cGas）的基因缺失显著降低 Npc1^-/-小胶质细胞的激活，减少小脑中的浦肯野神经元丢失，从而改善了运动功能。此研究揭示了一种独特的不依赖于cGAS/cGAMP的 STING 激活模式，它介导了NPC的神经炎症，并可能为治疗 NPC 疾病提供新的治疗靶点（图3）。

图3

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03762-2

制版人：十一

参考文献

1. Chin, A. C. Neuroinflammation and the cGAS–STING pathway. J. Neurophysiol. 121, 1087–1091 (2019).

2. Yan, N. Immune diseases associated with TREX1 and STING dysfunction. J. Interferon Cytokine Res. 37, 198–206 (2017).

3. Sliter, D. A. et al. Parkin and PINK1 mitigate STING-induced inflammation. Nature 561, 258–262 (2018).

4. Yang, K., Huang, R., Fujihira, H., Suzuki, T. & Yan, N. N-glycanase NGLY1 regulates mitochondrial homeostasis and inflammation through NRF1. J. Exp. Med. 215, 2600–2616 (2018).

5. Yu, C.-H. et al. TDP-43 triggers mitochondrial DNA release via mPTP to activate cGAS/ STING in ALS. Cell 183, 636–649 (2020).

6. Wu, J. et al. STING-mediated disruption of calcium homeostasis chronically activates ER stress and primes T cell death. J. Exp. Med. 216, 867–883 (2019)

7. Hung, V. et al. Spatially resolved proteomic mapping in living cells with the engineered peroxidase APEX2. Nat. Protoc. 11, 456–475 (2016)

8. Brown, M. S., Radhakrishnan, A. & Goldstein, J. L. Retrospective on cholesterol homeostasis: the central role of Scap. Annu. Rev. Biochem. 87, 783–807 (2018).

9.  Chen, W. et al. ER adaptor SCAP translocates and recruits IRF3 to perinuclear microsome induced by cytosolic microbial DNAs. PLoS Pathog. 12, e1005462 (2016).

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