Cell丨蔡尚课题组首次证实肿瘤菌群的重要生理功能
除了众所周知的遗传、表观遗传和基质微环境因素外，宿主微生物群作为一种不可忽视的身体组成部分，在调节癌症易感性和肿瘤进展方面也是一种至关重要的介质，它们的存在，为癌症生物学的研究增加了另一层复杂性。过往对肿瘤与微生物的研究主要集中在肠道菌群。肠道菌群主要通过间接途径（包括代谢物和免疫系统）在远处或近端肿瘤组织上发挥作用，影响癌症进展。传统观念认为，因为免疫系统的存在，人体绝大多数组织器官（除肠道、口腔、皮肤外）内部通常处于一个无菌的状态，肿瘤组织亦然。然而，近年来随着测序技术的发展，以色列及美国的部分科学家研究表明，细菌也是肿瘤本身的组成成分，它存在于结直肠癌以外更广泛的癌症类型中，例如胰腺癌、肺癌、乳腺癌等【1-3】。这类细菌绝大多数以较低的生物量存在于细胞质内，称之为“胞内菌”。然而，低生物量的肿瘤微生物是否在其生理状态下对肿瘤进展发挥重要的生物学作用仍然是一个悬而未决的问题。
2022年4月7日，西湖大学生命科学学院蔡尚课题组在Cell在线发表了题为 Tumor Resident Intracellular Microbiota Promotes Metastatic Colonization in Breast Cancer 的最新研究论文，他们首次证明生理状况下乳腺癌组织中独特的胞内菌在肿瘤转移定植过程中所起的关键作用。该研究鉴定了肿瘤微环境中长期被忽视的新成分，揭示了影响肿瘤转移的遗传、表观、代谢之外的新因素，开拓了肿瘤研究的新方向，为临床控制肿瘤转移提供了全新的视角。
在过去几年中，蔡尚课题组基于经典的MMTV-PyMT小鼠自发乳腺癌模型，构建了严格的肿瘤菌群研究体系，深入表征这群低生物量的乳腺肿瘤菌群，并探索肿瘤微生物在肿瘤进展中的作用。他们通过不同的染色方法如16S FISH分析，IHC以及IF来观察小鼠自发肿瘤里的细菌定位在肿瘤上皮细胞中，并进一步利用透射电镜来观察胞内菌。除此之外，他们对肿瘤组织里的细菌和肿瘤细胞里的细菌进行16S建库测序，生信分析显示肿瘤细胞里的细菌与肿瘤组织中的细菌物种组成非常类似。
接下来更重要的是探索肿瘤菌群的功能。作者创新性地采取多种抗生素和多种输入方式的策略来特异性地清除肿瘤菌群从而达到研究肿瘤菌群功能的目的，结果发现，利用尾静脉注射ATBx复合抗生素和Doxycycline饮水只清除肿瘤菌群之后，不影响肿瘤重量，但肺转移都显著下降。并且利用无菌小鼠模型同样验证了这一点，这证明肿瘤菌群具有促进肿瘤转移的生物学功能。
因为大多数细菌鉴定出来都是胞内菌，同时考虑到转移是一个多步骤的过程，包括从原位迁移进入血管、循环肿瘤细胞通过血液到达远端器官以及远端定植生长。作者假设肿瘤组织中的胞内菌可能会和肿瘤细胞一起迁移到达远端器官并影响转移。为了验证这个假设，他们对原位肿瘤（BT），肉眼可见的肺转移灶（LM），含有微小转移灶的肺组织（MAL），以及正常的肺（NL）和乳腺组织（NB）进行细菌16S测序。生信分析结果提示早期肺转移的细菌可能仍带有原位肿瘤的菌群特征，而随着肿瘤的进展则开始受肺部微环境的影响。另外，作者收集了MMTV-PyMT小鼠的外周血，共染角蛋白和细菌16S探针，可以看到循环肿瘤细胞能够携带肿瘤菌群到达远端器官。而回输这些肿瘤菌群，不影响肿瘤原位生长，但显著促进肿瘤转移，甚至让很少转移的肿瘤类型也开始大量转移。结合抗生素清除实验，作者有力地证明了肿瘤菌群促进转移的功能。
为了进一步探讨肿瘤菌群对于促进肿瘤细胞转移的机制，作者利用单细胞测序分析，找到了细菌入侵肿瘤细胞之后，特异性地上调液流剪切压力通路（图1）。事实上，肿瘤细胞在转移的过程中，尤其是在循环系统中，会经历液流剪切压力，这容易引起细胞死亡。体外构建液流压力系统以及体内尾静脉回输实验证明，经历压力之后，入侵细菌的细胞比对照组的细胞具有高的活性。这提示细菌入侵重塑了肿瘤细胞的细胞骨架，以此来抵抗液流压力，而RhoA-ROCK通路则被报道参与细胞骨架重排以及抵抗机械压力导致的死亡。因此，作者利用Western Blot以及FRET sensor analysis体外证明了胞内细菌抑制RhoA，重塑细胞骨架，并进一步构建了RhoA活性受抑制的肿瘤细胞，尾静脉注射和原位注射证明了RhoA受到抑制之后，能够促进肿瘤转移，这与细菌入侵的表型一致。
图1：胞内菌的入侵重塑了肿瘤细胞的细胞骨架，以此来抵抗液流压力的模式图
最后，作者收集了配对的乳腺癌病人的肿瘤组织、癌旁组织和淋巴结组织，用qPCR结合16S测序定量和定性地分析菌群的组成。结果显示，小鼠乳腺癌组织和人乳腺癌组织具有相同的微生物谱和动态变化，这提示，人乳腺癌菌群可能在人癌症发生和进展中起着相似的作用。
本项工作作者全面地描述了小鼠自发乳腺癌模型中的一定数量的胞内菌，这与乳腺癌病人里的类似。使用抗生素特异性地清除肿瘤菌群，显著降低肿瘤转移但不影响肿瘤生长。在生理条件下，这些胞内菌可以跟随着肿瘤细胞经过循环系统迁移到远端器官，并且促进乳腺癌细胞转移定植。作者进一步在机制上证明胞内菌可以调节宿主细胞的骨架，抵抗宿主细胞在循环系统中的液流压力从而促进癌细胞的存活。本研究为深入理解肿瘤转移提供了新的见解，也为临床上治疗乳腺癌开辟了新的思路。
西湖大学生命科学院蔡尚研究员为论文的通讯作者；西湖大学生命科学学院博士后付爱坤，西湖大学博士生尧冰清和董婷婷为本文的共同第一作者。
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蔡尚课题组的研究主要以乳腺为模式器官，探讨乳腺干细胞在青春期、孕期、哺乳期对乳腺特定结构功能的维持，以及乳腺癌干细胞在癌症的发生、发展、抗药性、复发及转移过程中的重要作用。近期的研究开辟了肿瘤菌群生理功能的新肿瘤研究方向，是一个充满未知的新兴领域，期待有兴趣探讨肿瘤菌群的优秀博后的加入，共同解开微生物与癌细胞互作之谜。
实验室网页：https://www.cai-lab.com
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.027
参考文献
1 Nejman, D. et al. The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science 368, 973-980, doi:10.1126/science.aay9189 (2020).
2 Riquelme, E. et al. Tumor Microbiome Diversity and Composition Influence Pancreatic Cancer Outcomes. Cell 178, 795-806 e712, doi:10.1016/j.cell.2019.07.008 (2019).
3 Jin, C. et al. Commensal Microbiota Promote Lung Cancer Development via gammadelta T Cells. Cell 176, 998-1013 e1016, doi:10.1016/j.cell.2018.12.040 (2019).
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