专家点评STM丨卢敏团队发现390个可治疗的p53突变体，并首次在人体内实现抑癌蛋白靶向

点评丨陈赛娟（上海交通大学医学院附属瑞金医院）、朱冰（中科院生物物理研究所）、Jiandong Chen（美国莫菲特癌症中心）

抑癌蛋白是一类抑制癌症发生、发展、转移的关键蛋白。一半以上的癌症驱动突变发生于抑癌蛋白，然而目前临床使用的约80个靶向药物几乎全都靶向癌蛋白，无一靶向抑癌蛋白（图1），很大程度造成了只有2-13%的癌症患者有靶向药物可用的临床现状【1, 2】。蛋白功能抑制策略（往往是用小分子竞争性占据蛋白活性口袋，进而抑制蛋白功能）具高度逻辑性，催生了大量功能抑制剂；但蛋白功能恢复策略（用小分子结合蛋白并恢复其功能）却缺乏理论基础和逻辑支撑，至今尚未建立，这导致科学家难以逻辑性设计或筛选恢复抑癌蛋白功能的化合物（简称恢复剂）。

抑癌蛋白p53是癌症中突变频率最高的蛋白，在约50%癌症患者体内发生突变（图1），使得p53成为历史上、以及现在被研究最多的蛋白【3】。领域奠基人之一David Lane于2019年在Nature Reviews Clinical Oncology上综述至少有45个团队致力于靶向p53突变，然而已报道的几十个p53恢复剂seem to restore mutant p53 with wild-type p53 activity, to varying extents, but are far from being able to achieve the desired outcome of converting all mutant p53 molecules to become fully wild-type-like（看起来好像可以不同程度地恢复p53突变体的野生型功能，但离完全恢复p53的功能还很远） 【4】。如能获得有效的p53恢复剂，有望在科学上开启抑癌蛋白靶向治疗，在临床上大幅增加靶向治疗的受益人群。

图1. 癌症中最高频发生突变的100个基因。药丸表示获批的靶向抗癌小分子。

卢敏团队前期根据p53突变体可以分成不能折叠的结构型突变体、DNA结合氨基酸发生突变的DNA结合型突变体等等各种各样不同类型的突变体，于2021年提出“促进结构型p53突变体重新折叠”的功能恢复策略，据此获得结构型p53突变体功能恢复剂三氧化二砷ATO（arsenic trioxide），并揭示其稳定p53三级结构的促折叠机制【5】（见BioArt报道：专家点评Cancer Cell丨 卢敏等实质性获得靶向药物的圣杯—— p53突变体复活剂）。和其余已报道的20余个广谱性p53恢复剂相比（注：PhiKan083、PC14586等恢复剂只靶向p53-Y220C单个突变体，不在本文讨论范围），该研究具有四个特征：1）效率上，ATO稳定p53结构、促进p53重新折叠的效率均高于其余p53恢复剂多个数量级【5】，论文发表后ATO被广泛验证为有效的p53恢复剂，2）机制上，ATO释放砷原子并在p53内部共价胶联（因为大侧链强疏水氨基酸124/135/141在人类p53中进化成小侧链中疏水氨基酸而导致松散结合的）LSH和β-sandwich结构域【5】，进而如预期稳定p53三级结构，这促使难以折叠的结构型p53突变体在变性复性平衡中倾向于折叠，进而实现p53突变体的功能恢复；其余p53恢复剂的工作机制目前未知，它们往往修饰p53上单个暴露的半胱氨酸，但修饰单个半胱氨酸如何能够提高p53结构稳定性仍然未被理解【6】；3）适用范围上：IARC数据库已经记录了超过2000个不同的p53突变体，这些突变体因为各种不同的机制而失去功能（比如不能折叠的结构型突变体、DNA结合氨基酸发生突变的DNA结合型突变体、无义突变体、四聚化功能缺失的突变体等等），因此很可能不存在可以恢复所有p53突变体的功能的全能恢复剂。目前ATO已被测试用于癌症中突变频率最高的25个p53突变体，并发现如预期一样ATO能恢复、且只能恢复结构型p53突变体的功能【5】；其余恢复剂在过去20余年来，未有团队系统性研究它们能够恢复哪些p53突变体的功能，目前这些恢复剂被用于任意p53突变体的功能恢复；4）临床试验上：ATO进入5-7项注册临床试验，并基于相互一致的功能恢复理论、结构学机制、和恢复效率实测结果，被用于治疗携带能被其恢复功能的结构型p53突变体的癌症患者；其余p53恢复剂进入约16项项临床试验，被用于治疗携带任意p53突变体（包括无义、移码p53突变体）的癌症患者。

然而转化该发现面临三项挑战：根据2022年Nature Reviews Clinical Oncology所荟萃分析的各种临床试验【7】，ATO是目前正在开展临床研究最多的p53恢复剂，然而这些研究面临三项挑战：1）哪些p53突变体可以被ATO恢复功能进而用于临床治疗？2000多个p53突变体中，前期仅仅测试了25个最常见的突变体。2）ATO靶向p53时是否具有治疗窗口？ATO在人体治疗时具有毒副作用，其在人体内恢复p53功能所需的浓度是否低于产生显著毒副作用时的浓度仍然未知。3）p53是否是一个有治疗价值的靶点？恢复p53功能可以在体外高效杀死癌细胞，也可以在体内引起小鼠肿瘤的消退，但不代表在更为复杂的人体内一定可以产生治疗效果，亟待概念性验证。

2023年4月5日，上海交通大学医学院附属瑞金医院卢敏团队在Science Translational Medicine上发表论文Diverse rescue potencies of p53 mutations to ATO are predetermined by intrinsic mutational properties，基本解决了以上三项挑战：1）测定了ATO对800个癌症中最常见的p53突变体的功能恢复效率，鉴定并公开了390个可以被ATO恢复功能进而用于临床治疗的p53突变体（www.rescuep53.net）；2）据此提出基于每一个单独p53突变体（而非不区分突变体、或者只区分突变类型）的高度精准治疗理论（A highly precise targeted therapy based on individual mutant alleles）；3）最后利用该精准策略，首次在人体内（first-in-human）实现p53功能恢复，并减少白血病患者的微小病灶残留。

首先，研究逐个克隆并测试了ATO对800个p53突变体的转录活性、抗细胞增殖活性、抗小鼠xenograft生长活性的恢复效果，发现在三个检测系统中的实验结果较为一致：有390个p53突变体可以被不同程度地恢复功能。

对功能恢复效率较高的突变体进行进一步分析，发现它们有两个共同特征：1）发生突变的氨基酸的溶剂可及性低（亦即被掩埋在蛋白内部，这类突变往往是结构型突变），这验证了前期发表的ATO的工作机制以及对25个高频突变体的测定结果【5】；2）这些突变体往往是温度敏感型突变体[温敏型突变体是结构型突变体中的一个亚型，其定义是指在低温培养时（因为蛋白重新折叠而）能恢复功能的突变体]。针对强、弱、无温敏特性的V272M（即第272位的Val突变成Met），G245S和R249S突变体的共结晶结构分析表明，在折叠转态下温敏性越高的突变体组装出来的DNA结合面和野生型越接近，这从底层解释了不同p53突变体具有不同成药性的原因：如果p53所处的环境的温度（T_ambient）大于p53蛋白的熔解温度（T_m，熔解温度指p53发生变性时所需的温度，每个p53突变体都有其固定的T_m），蛋白变性，处于不折叠状态，没有功能；当T_ambient 小于T_m时（比如使用ATO来提高T_m、使用第二位点的促结构稳定性突变来提高T_m、使用低温培养细胞来降低T_ambient等等方法都可以使T_ambient 小于T_m），蛋白复性，处于折叠状态，但只有温敏型突变体可以被恢复功能，非温敏型突变体则不可以被恢复功能，其底层的机制是：折叠状态下的温敏型突变体如V272M和M133T能够组装出和野生型一致的DNA结合面，因此可以重新结合DNA并恢复功能；而折叠转态下的非温敏型突变体如R249S则组装出大幅扭曲的DNA结合面，因此不能结合DNA故不能被恢复功能。V272E和M133R尽管也发生于272和133位氨基酸，但这些突变在p53内部导入大侧链氨基酸，使p53内部完全不兼容，蛋白极难重新折叠，因此其Tm值极低，恢复剂和低温往往不足以实现T_ambient < T_m，因此蛋白难以重新折叠，难以被恢复功能；R175H和G245S是介于高温敏和无温敏之间的弱温敏突变体，它们再重新折叠后DNA结合面仍有轻微扭曲，因此，其DNA结合能力和抑癌功能只能被部分恢复。

之后，研究根据（p53突变体在三个检测系统中）功能恢复效率的高低，把p53突变体分成三类：可以被完全恢复功能的type-1型突变体，有33个；可以被恢复较多功能的type-2a型和被恢复较少功能的2b型突变体，有357个；不能被ATO恢复功能的type-3型突变体，有410个。之后研究对ATO恢复这三类突变体抑癌功能的能力进行了验证。对源自10个癌种的47株细胞系的体外细胞培养研究表明，ATO对 type-1型和type-2a型p53突变体具有更好的功能恢复效果，且不限癌种；对3个isogenic CDX小鼠模型、源自五个癌种的7个PDX“小鼠临床试验”的研究均表明，ATO对携带type-1型和type-2a型p53突变体的小鼠肿瘤具有更好的治疗效果，且不限癌种。

最后，研究提出基于每一个p53突变体功能恢复效率来入组患者的高度精准治疗理论。在几乎所有血液系统肿瘤亚型中，p53突变都意味着极差的预后（风险比/Hazard Ratio/HR高达2.5-6.0），p53突变血液肿瘤患者对化疗、靶向治疗、免疫治疗、甚至骨髓移植都不敏感且易复发；ATO获批治疗的APL白血病是髓系急性白血病AML的一个亚型，且AML患者发生p53突变后预后极差（HR高达2.5-4.2）。根据这些信息，研究发现一位携带type-1 p53突变体的非APL AML患者。ATO单药（临床治疗APL时的剂量：0.16 mg/kg/day）治疗后，对患者体内单个核细胞进行单细胞测序，结果表明：1）患者体内癌细胞中的经典p53靶基因如CDKN1A、BBC3/PUMA、GADD45A、MDM2等发生了与体外细胞培养体系研究中一样高效、特异地上调，这证实了p53抑癌功能所依赖的转录活性已被恢复；2）血液样品中微小病灶残留MRD显著减少，其主要marker CD34、CD117、CD13、CD33、CD45的表达水平均发生显著、大幅下调。

该研究潜在的科学价值：在靶向治疗领域，首次在人体内实现抑癌蛋白功能恢复；在p53领域，首次在人体内实现p53功能恢复，并概念性证明p53这个靶点具有潜在的临床治疗价值。此外，研究还建议筛药工作者准确地选择具有高成药性的type-1型突变体（如V272M，而非领域内常用的DNA结合氨基酸发生突变的R273H等突变体），逻辑的进行基于蛋白热稳定性（hypothesis-driven）的药物筛选；建议临床工作者基于逻辑的理论、明确的结构学机制、和实测结果，精准的选择携带可被恢复剂高效恢复功能的type-1&2型突变体（如V272M等，而非入组携带任意p53突变体的患者）的癌症患者进行临床研究。该研究潜在的临床价值：在ATO老药新用上，发现具有毒副作用的ATO在人体内靶向type-1 p53突变体时具有潜在的治疗窗口；在潜在可适用癌症患者上，p53突变存在于约50%癌症患者，结构型p53突变存在于约20-30%癌症患者，可被ATO恢复抑癌功能的type-1&2突变存在于11.6%癌症患者，可被ATO完全恢复功能的type-1突变体存在于0.48%癌症患者。研究局限性：ATO靶向p53突变体的机制和靶向APL（5年生存率90%以上、唯一被靶向药物治愈的癌症类型）中驱动突变体PML-Rara的机制类似（胶连三个空间结构靠近的半胱氨酸【8】），ATO在临床实践中被偶尔报道具有治疗各类实体瘤癌症患者的疗效，ATO在本概念性研究中的可以在人体内恢复p53突变体功能，然而这三点都不能充分证明ATO具有依赖于p53功能恢复的抗肿瘤疗效（前瞻性、大规模、双盲、随机对照临床试验中获得统计学显著的结果，在大多数时候是确证药物临床疗效的唯一方法）；ATO具有体内治疗毒副作用，因此建议前期探索性临床试验只入组type-1 p53突变体患者，然而这一类型p53突变的泛癌种中的发生率只有0.48%，在AML中的发生率低至0.05%-0.1%，因此在患者入组上可能面临挑战；此外，ATO作为老药，往往只能进行研究者发起的临床试验，可能加剧患者入组上的挑战。

卢敏是论文通讯作者；宋花歆是论文第一作者；宋花歆、吴佳乐等负责功能相关实验；宋花歆、唐亿钢等负责结构相关实验；方海、代雨婷等负责生物信息学相关实验；吴文、张苏江、李军民、吴俣等负责临床样品相关实验。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/scitranslmed.abn9155

专家点评

陈赛娟（上海交通大学医学院附属瑞金医院研究员，长期从事白血病研究）

p53是一个特殊的蛋白，它具有上千个不同的突变，且高频发生于几乎所有癌种。这意味着p53靶向药物广泛的使用范围，但也带来了p53靶向治疗的两项特有挑战：选择什么p53突变体？选择什么癌种？卢敏团队发表于本期Science Translational Medicine的论文解决了第一个挑战，实测了ATO对近千个p53突变体的功能恢复效率，发现可潜在用于治疗的390个p53突变体，并在非急性早幼粒细胞白血病患者上观察到标准剂量ATO给药可以恢复p53功能。这些概念性发现在p53靶向治疗领域有重要价值，但在ATO领域，这些概念性发现离确证ATO靶向p53具有临床疗效还有较远的距离，需严谨、更大规模临床试验验证。

p53恢复剂临床试验的第二个挑战则从未有人涉及。在ATO靶向p53临床试验选择癌种时，研究者首先会想到与治疗APL时具有相似药代药动且具有使用安全性的急性髓系白血病AML。AML患者发生p53突变后预后不佳，一些NCCN治疗方案甚至为此排除p53突变的AML患者。但需意识到，临床治疗的可及性和未满足的临床需求，并不等同于该癌种就是最可能取得疗效的癌种。研究者还往往会想到p53突变率达80-95%的高级别浆液性卵巢癌、小细胞肺癌、食管癌等等癌种，但这也不一定意味着这些癌种是最佳的适应症，而可能仅仅提示p53突变发生于这些癌种的发病早期。

那么最佳适应症是什么？能预测吗？癌症是一种复杂的疾病，具有高度异质性。同一位患者往往存在多个不同基因的驱动突变，p53可能不是主导的基因突变（亦即在该患者中不是唯一的驱动突变基因），这时使用ATO单药靶向p53突变，疗效可能有限。STM论文中仅有一例接受砷剂治疗的AML患者的疗效观察，而且是初步的疗效观察，不足以判断ATO单药治疗方案的疗效。因此，ATO靶向p53治疗方案可能需要联合靶向治疗才更可能有疗效。但如果反过来，如果某一位癌症患者体内的p53突变是唯一的驱动突变，亦即这位患者不存在其余癌症驱动基因的突变，那么这位患者更有可能受益于ATO治疗。

除了以上肿瘤异质性需要考虑以外，选择癌种时还需要考虑的因素有很多，包括但不限于p53突变对患者生存的风险比（HR），MDM2表达水平，p53本身的活跃程度等等因素。理论上，如果p53失去功能以后患者预后越差（比如p53突变的HR越高），那么用药物恢复p53功能后患者临床受益的可能性就越高。理论上，p53功能恢复后还会受到MDM2抑制，因此MDM2低表达可能是筛选癌种的一个潜在指标。理论上，如果某个癌种中的野生型p53功能特别活跃，那么这种癌种中发生p53突变的病人进行ATO给药后，重新折叠的p53突变体也能发挥活跃的抑癌功能，因此更有可能取得疗效。

从整个靶向治疗领域看，p53以外的抑癌蛋白仍然缺乏研究。比如癌症和抑郁症中都高频发生突变的抑癌蛋白PTEN，不仅缺乏靶向药物，甚至缺乏在实验室水平的研究尝试和文献报道。在工业界，因为巨大的研发风险，绝大多数小分子药物靶向研究都集中于癌蛋白，甚至有很大一部分聚焦于一小戳已经开发出多个靶向药物的癌蛋白。学术界对失败的研究更为包容，应积极开展面向未满足临床需求的新靶点的研究，尽管研究新靶点具有高风险。总之，靶向治疗领域可能不是一个成熟、缺乏更多潜力可挖的领域，更像是一个尚处于初级阶段的研究领域，毕竟绝大多数明确的癌症治疗靶点都缺乏靶向药物。

专家点评

朱冰 (中国科学院生物物理研究所，长期从事基因转录的表观调控研究)

拯救伤兵p53。基因突变是多种疾病发生的原因。传统上，修复一个功能丧失的基因需要依赖基因治疗，也就是说得将好的基因转入到发生了突变的细胞中去。基因治疗手段在治疗特定的遗传性疾病中已经取得了重要的进展，然而要应用到肿瘤治疗中去还因肿瘤细胞的异质性和克隆扩增能力，而面临着巨大的技术挑战。

转录因子p53编码基因的突变和功能丧失是肿瘤发生过程最常见的事件，上海交通大学瑞金医院卢敏团队针对p53编码基因突变走出了一条新的道路。由于p53突变是肿瘤中最常见的突变，其突变类型多种多样。在这些突变中，有些并不是完全杀死了p53蛋白，而只是把p53蛋白变成了一个伤兵。而卢敏团队提出的策略就是将这些伤兵拯救回来，恢复其功能，从而实现对此类患者的精准治疗。

卢敏团队此前已经提出了针对发生了蛋白质折叠错误的p53伤兵，利用老药三氧化二砷稳定p53突变体结构，从而恢复其转录因子活性的策略。然而p53突变种类多种多样，究竟哪些突变的p53是可以拯救的伤兵就成了关键的科学问题。在本项工作中，他们测定了三氧化二砷对肿瘤中发生频率最高的800多种p53突变的拯救能力，发现其中390种p53突变可以被拯救。这对针对携有此类突变的患者，开展精准入组的临床试验有着重要的指导意义。

专家点评

Jiandong Chen (美国莫菲特癌症中心，从事p53恢复剂研究超过20年)

由于表达和积累无活性突变体 p53 蛋白的肿瘤比例很高，开发能够挽救突变体 p53 肿瘤抑制活性的药物已成为 p53 研究的重要目标。这一领域的成功有可能使大量癌症患者受益。在过去的二十年里，已经有一些化合物和肽被报道能够挽救突变体 p53 的活性。大多数这些发现的一个共同特征是缺乏提供全面评估和验证的独立后续研究。在不清楚它们的活性、特异性和机制的情况下，其他实验室随意使用这些化合物可能会获得希望观察到的肿瘤抑制等表面结果，但可能会产生误导性的结论。在相当长的一段时间内，缺乏透明度和合理的理论框架减缓了开发突变 p53 拯救药物的进展。卢敏课题组最近发表的几篇关于ATO介导的突变体p53拯救机制研究的论文是该领域令人耳目一新的重要进展。除了发现一种高效且经过独立验证的突变体 p53 拯救化合物外，他的团队还进行了大量实验，全面了解砷原子与突变体 p53 的相互作用如何导致结构稳定和功能拯救。本文详细分析了多种因素对ATO拯救效率的影响，如不同的氨基酸突变、位置和p53突变体的内在特性（温度敏感性）。这些发现为 ATO 在结构水平上拯救突变体 p53 的机制提供了一个新的、合理的认识。该论文还对使用 ATO 靶向突变体 p53 的毒性问题和有限的临床空间进行了客观评估。

此外，他们对许多以前的突变体 p53 激活化合物进行了比较分析，为打算在他们自己的实验中使用此类化合物的研究人员提供了很少报道但非常宝贵的信息。卢敏课题组在突变p53拯救方面的开创性研究，不仅对该ATO的临床应用产生直接影响，也将为未来针对突变p53的研究提供重要参考。

制版人：十一

参考文献

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5. Chen, S., et al., Arsenic Trioxide Rescues Structural p53 Mutations through a Cryptic Allosteric Site. Cancer Cell, 2021. 39(2): p. 225-239 e8.

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9. Martinez-Jimenez, F., et al., A compendium of mutational cancer driver genes. Nat Rev Cancer, 2020. 20(10): p. 555-572.

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