各种检测技术如何更好地联合应用？曹涵、闫丽盈、周家蓬、张翼

顾大夫沙龙第一期内容梳理：各种检测技术如何更好地联合应用？

讲者：曹涵  Bionano创始人及首席科学家

题目：绘制复杂基因组中的致病暗信息-高通量下一代单分子基因组图谱技术

嘉宾发言：

闫丽盈  北医三院生殖中心研究员

周家蓬  北京希望组生物科技有限公司首席技术官

张  翼  北京优乐复生科技有限公司创始人&CTO

曹 涵

闫丽盈

    各位老师大家好！我来自北医三院生殖中心，我叫闫丽盈。非常感谢顾大夫以及赛福基因来组织这个沙龙，其实这个主题特别适合我们，现在好多问题我们接收到很多诊断未明的病例该怎么办？今天来听也确实给我很多启发。那么这个讨论的环节就是如何更好地联合应用多种技术在我们临床诊断中应用。

     我的主要工作其实是结合辅助生殖技术，进行胚胎着床前的遗传疾病的诊断。其实联合多种技术，在我们这里是最充分的体现。因为联合多种技术的目的，一方面可能就是为了让我们得到更准确的结果，同时也是为了能够降低成本，能够得到更好的结果。

     对于我们来说，面对的诊断的材料可能就一个，或者几个细胞。这个时候不光是诊断方法，我们中间还有一些扩增的方法，可能某一种诊断方法对于这种扩增的材料可能不能准确地诊断，像我们做单基因疾病，对胚胎单细胞进行诊断，必须联合多种技术。比如，我们可以用Sanger测序对单个致病位点进行分析。但往往这个单细胞扩增过程中会有拖后现象，所以我们必须联合SNP或者STR连锁分析来保证这个位点的诊断是准确的。同时因为我们担负的是挑选一个好的胚胎，将来要发育一个正常的、健康的孩子,所以我们必须不仅是这个点要诊断正确，同时我们要保证它百分之百，甚至百分之二百地用多种技术来说一个结果，说它是对的。在诊断中往往会有直接位点，即使看到了我们还要连锁分析，可能我们在胚胎看到了，如果在女方遗传的，我们还要在极体上进行测序，甚至我们会多个标本同时相互验证，也就是多种方法联合统一出一个结果，这是我们最需要的。

另外一个，就是在我们这里，同时开展多个技术来得到一个更好的结果，但是在有的情况下，这种多种技术联合应用，有时候是顺次的，不一定在接到这个病例的时候，就需要一下子多管齐下，可能要顺次采用某种技术。有的病人需要我们确定致病基因，可能还有明确的表型，也许从某个panel试起，如果找不到，可能会扩大范围，做外显子测序，如果找不到会做全基因组测序。

即使这样，像刚才这位老师讲的，其实还有很多病例仍然找不到致病基因，像在我们这儿，有一些反复胎儿畸形或者反复流产、胚胎停育的病例，可能我们一共纳入了60个，也只有20来个病例能找到，觉得是明确的致病基因，真正让我们敢做PGD，或者是产前诊断的，其中也就只有10多例。所以我们往往从不同的层次上找到致病基因，用多种方法来验证它，再结合家系的分析。有的时候我们认为找到了致病基因，再去根据家系，发现其实不是这个致病基因。

    所以在我们的工作中，可能各位老师都帮助过我们，帮助我们来确定基因型和表型之间的关系。同时在座有好多检测公司，我们可能同一份标本会给几个公司，为了就是得到一个更准确的致病基因。所以在这多种方法检测对于我们来说是非常重要的。

    谢谢大家！

周家蓬

    首先非常感谢顾老师、黄老师的邀请！我是来自于北京希望组周家蓬。我特别感激曹涵老师在前面有一个介绍，省去了我很多解释的过程。因为我们公司现在也是以三代测序为主，像曹涵老师的BIONANO平台我们也有一台，而且我们用BIONANO平台已经成功地研发了面肩肱的诊断检测，相关的软著已经授权，专利也都提交上去了，然后文章也很快要投稿。

    我想说的是，这些新的技术真的是非常powerful。所以如果遇到一些疑难杂症的话，真的可以去尝试一下。我之前是在吴士文主任的课题组工作，我是做DMD的。我们当时遇到了很多的稀有的病例，所以我当时就想最终可能是需要三代测序来解决，因为这个原因后来就直接到三代测序这个领域来工作了。

    包括曹老师前面介绍的，DMD发现一例inversion（倒位）的现象，我们知道之前国际上一些组织从来没有任何文章报道说DMD有inversion的现象，所以这是一种非常有趣的发现。而且我们后来把这种发现推广到很多单基因病领域的时候，我们发现了更多非常有趣的、复杂的结构上的变异。所以对于这种遗传的因素来说，可能传统的一些，不是说一代、二代技术不好，可能它有自己不擅长的、解决的方面。所以，像光学图谱BIONANO的平台，像三代测序的一些平台，有可能这是它所擅长的一些领域。所以，我希望大家如果遇到一些自己比较难以解决的这种疑难杂症的话，可以考虑我们这些平台。

    接下来我想说，因为这个主题是说要怎么去联合应用，我觉得我们不能只是讨论我们自身，我们要考虑患者、医生和检测机构三方的密切合作的问题。从患者层面，你要考虑怎么样替患者省钱，你不可能说给他推荐特别贵的全基因组检测，整个家系全上，因为这个对他的家庭来说负担是很重的。所以说，我们要从为患者考虑，我们要提供最实惠的检测方案。这就需要我们与患者、医生、检测机构去互相沟通。

    作为公司方，我们希望患者家属能够提供给我们更丰富的家系样本和信息，我们希望医生提供我们更详尽的临床的记录。反过来，我们也愿意把我们所能够发掘的数据的信息、知识更好地去分享给大家，我们是非常乐意去做这样共享性的工作的。

    所以我相信通过像顾卫红老师这样越来越有情怀的专家去推动这种三方的合作，我相信整个遗传病的诊断会发展得越来越好，而且我们会真正地发掘出遗传病的机理。因为我之前是做复杂疾病的，我是从GWAS领域转回到单基因病领域的。因为GWAS领域，你做了很多之后，你发现很多机理解释不清楚，所以我又返回到单基因病领域。我觉得单基因病是一把真正关键的钥匙，会把每一个基因的机理非常详尽地揭示出来。然后我们把单基因病先做好，再回过去做复杂疾病，像高血压、糖尿病、癌症之类的，可能会取得更好的结果。

谢谢大家！

张 翼

谢谢顾老师、黄老师的邀请！我是优乐复生的张翼。今天非常荣幸在这和大家讲一下，讨论一下这个话题，就是各种检测技术如何更好地联合应用。

      我们觉得现在的检测技术五花八门，但是对于每一个技术的能力，我们有没有很好的认识，这个首先是一个问题。就是说每一个技术都有它的能力和局限性，比如我们现在市场上常见的有panel、全外、低覆盖的全基因组、高覆盖的全基因组、一代测序、MLPA，还有很fancy的一些新技术，三代测序、BIONANO等。根据病人不同的表型，我们能不能猜到可能适用于哪一种技术，假如我们猜不到的话，有没有一种技术是万能的，而实际上是没有一种万能的技术。比如我们说小panel可以解决一些嵌合的问题，它测得足够深。但是它做不了CNV、SV，做不了它没有猜到的这些基因。全外可以做一部分的嵌合，但是它在CNV上的表现就比较差，它也看不了UTR（非翻译区），或者看不了像刚刚曹老师说的这种所谓的暗物质这种结构变异大的东西。高覆盖的全基因组是能够整个基因组都覆盖过去的，但是在这个时候它实际上是看不到嵌合病的。所以说首先这个病人的表型，我们是不是明确，假如说我们认为我们明确的话，究竟多明确？我们也收到过认为是遗传病的，最后测出来是寄生虫的。也有认为是某一种遗传病，但是做下来是另外一种遗传病的例子。就是说，假如这个表型明确的话，到底有多明确？有没有一个分数？有没有一个标准？实际上现在是没有这样的东西，首先是确定我们怎么样选择一个检测技术的前提。

     第二个，就是即使是我们选择了某一个检测技术，但是目前为止对于这个检测技术的质量的QC（质控），我们没有一个标准。前几天我们讨论这个基因捕获的一个标准，大家现在制定的bar还是比较low的，比如说95%以上的区域要能够覆盖到30X，也就意味这你就漏了5%的区域，5%的区域很可能就落了一个致病位点。如果我们要把这个覆盖度提高的话，可能成本、技术、时间上面又会撑上去。在这种情况下怎么去balance这件事情。肿瘤领域可能相对比较好，因为大家打得一片火热的，所以一天到晚都在做室间质评。但是，对于遗传病，现在不要说室间质评了，连性能验证都没有，你最低能够探到百分之多少的东西呢？有没有人真的去测过自己的panel在10%的时候有百分之多少的概率能够把它测出来，这个东西从来就没有人做过。

我们也会有一些会诊、联盟、共享信息，就是看遗传病、疑难杂症这些服务。然后在这个时候，实际上我们面对的常常是一些低质量的数据。比如刚刚华大黄老师说的，比如有一个很低质量的或者是很深的内含子里面的一个东西，常常大家是不会注释到的，或者大家直接就把这个东西滤过去了。我们看到这个东西的时候，我们怎么办呢？所以，目前我们自己在想，能不能够有一个临床的路径指南，首先我们要怎么样明确这个表型，用什么样的路径去问这个表型，明确这个表型，收集这个表型。收集了这个表型以后，选择哪个技术，有没有一个很明确的指南，我符合哪些条件，选取哪个技术。然后选取这些技术的时候，有没有达到一定的质控标准，然后怎么样来安排检查的顺序。如何来提供这一系列的东西，我们其实是非常愿意跟大家一起来做的。

      新的技术很多，都非常的先进，都看起来很有希望，比如除了我们刚刚讨论过的可能还有什么甲基化、单细胞各种各样的高级的东西，还有RNAseq，怎么样嵌入到我们现有的检查体系里面去，实际上大家现在都不知道。

      我们觉得实际上数据的可信度，这些其实是有问题的。连这些大家现在都没有一个很好的标准。比如这个数据质量OK不OK，我们能不能够重新做分析，如果我们重新去测，这个成本很高，如果我们重新去分析的话，人力成本很高，公司的负担很大。但是从道德上面来说，病人很穷，怎么办？我们是凭理性做，还是凭良心做，这个免费也要给他分析出来，花很多时间把这个东西给分析出来，但实际上作为卫生经济学来讲，这样子又是不合适的。

      所以我们觉得最后组合各种检测方案，我们应该充分地评估技术路线和组合的效率，从经济性、检出率、速度和应用性各方面去整理一个临床路径出来，选取对病人最优的、最好的路线，根据现有的知识。我们很乐意跟大家一起来做这些事情。

      谢谢！

感谢黄尚志老师、承办方赛福基因、协办方人人实验和测序中国对本次沙龙的大力支持！

嘉宾发言整理：测序中国、顾大夫

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