miR-936 在精神分裂症中增加并抑制神经发育和 AMPA 受体介导的突触传递

背景

精神分裂症是一种严重的精神疾病，表现出幻觉、妄想和认知障碍等症状，其通常出现在青春期后期和成年早期。精神分裂症患者的认知障碍与认知加工过程中背外侧前额叶皮层(DLPFC)的激活减少有关。DLPFC有一个漫长的成熟轨迹，随着突触连接、工作记忆和情绪调节功能的成熟，其整体microRNA (miRNA)表达的稳定持续到青春期后期。这种成熟的延迟延长了依赖经验的大脑可塑性，但使DLPFC在大脑发育过程中容易受到干扰。miR-936是一种在精神分裂症患者 DLPFC中增加的特异性miRNA。miR-936升高对精神分裂症的意义尚不清楚。本研究在一个独立队列中验证了miR-936的表达变化，检测了miR-936在人体DLPFC中的层状和细胞型分布，并探索了其在个体诱导多能干细胞(iPSC)衍生的谷氨酸神经元中的功能。

方法

1、人类大脑样本：人脑组织由NIMH人脑收集中心提供。

2、iPSCs的分化：WTC11i iPSCs采用两步方案（预分化和成熟）进行分化。预分化时，将iPSCs接种在涂有Matrigel的平板上，在含有N2补充物、非必需氨基酸、小鼠层粘胶蛋白、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、Y-27632、SB431542、XAV939、LDN193189和多西环素的KnockOut DMEM培养基中培养3天。成熟分化，将预分化细胞与大鼠胶质细胞在涂有聚乙烯亚胺的盖玻片上和含有50% DMEM/F12、50% Neurobastal-A培养基、0.5×B27、0.5×N2、谷氨酰胺、NEAA、小鼠层粘连蛋白、BDNF和NT3的培养基中共同培养。 

3、RNA提取和定量聚合酶链反应、荧光原位杂交（FISH）、免疫标记、图像采集与图像分析等。

4、电生理实验

结果

1、miR-936在人体DLPFC中的层流和细胞型分布

我们将miR-936探针应用于人体DLPFC切片，通过免疫组化检测皮层中Cux1和微管相关蛋白1B (MAP1B，富集于5/6层)。miR-936在皮质层中分布不均匀，在第2层中信号最强(图1A-D)。与我们之前的研究结果一致，精神分裂症样本的DLPFC中miR-936在第2层到第6层增加(图1C和1D)。我们进一步检测了表达miR-936的细胞类型，使用双FISH表达miR-936和vGluT1(一种谷氨酸能神经元标记物)，以及FISH联合IHC表达miR-936和GAD-65/67(一种GABAergic神经元标记物)。我们测量了Manders共定位系数(MCC)，这表明在2/3层的细胞中，一个蛋白与另一个蛋白共定位的比例，因为它们有相对较高的miR-936表达和细胞密度。在vGlut1+和GAD-65/67+细胞中均检测到miR-936, SCZ样本中表达miR-936的vGlut1+细胞较多，而表达miR-936的GAD-65/67+细胞较少(图1E、1F、1I)。在SCZ样本中，单个vGlut1+细胞表达更多miR-936，而GAD-65/67+细胞中的miR-936表达没有变化(图1G和1H)。在GFAP+胶质细胞中未检测到miR-936(图1K)。

图1 miR-936在人体DLPFC中的表达

  2、miR-936增加iPSC衍生的神经元(iNs)的内在兴奋性和AP阈值

为了评估miR-936增加对谷氨酸能神经元的影响，我们使用了来自人体iPSC细胞系WTC11i的神经元。将大鼠胶质细胞以2:1的比例(2个iPSCs, 1个胶质细胞)添加到iPSC培养物中，为iNs的发育提供结构和代谢支持。形态学和电生理分析表明，诱导多能干细胞已分化为谷氨酸神经元。为了检验我们的iNs是否具有神经元的电生理特性，我们进行了全细胞膜片钳记录。旧iNs比新iNs有更低的输入电阻(R_in)，更大的电池电容(Cp)和更强的超极化静息膜电位(RMP)。从第14天到第56天，动作电位阈值和半宽度(AP)降低，基强度(触发AP的最小电流)、AP振幅和电流注入诱发的AP数量增加。这些电生理特性随年龄的变化与在iNs中观察到的以及在啮齿动物出生后谷氨酸神经元发育过程中观察到的变化相似。  

接下来，我们使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-936是否在iNs中表达。miR-936在iPSCs、第3天iNs和第15天iNs中忽略不计，但在第60天iNs中可以检测到(图2A)。为了检测miR-936在iNs中的功能，我们将表达GFP的慢病毒和miR-936、miR-936Δ(miR-936突变体，不能与miR-936靶点结合)、miR-936-sponge（可与miR-936靶点结合）转导到第3天iNs中进行功能缺失研究。在第15天和第60天iNs中，miR-936和miR-936Δ慢病毒分别增加了miR-936和miR-936Δ，而miR-936-sponge慢病毒降低了miR-936(图2A)。病毒表达miR-936或miR-936-sponge后，RMP、Cm、AP振幅和AP半宽度均没有变化。然而，miR-936提高了AP阈值，降低了电流注射诱导的AP数量(图2B-E)。此外，iNs过表达miR-936时R_in升高，基强度降低(图2F和2G)。miR-936Δ没有影响上述电物理性质(图2B-G)。因此，miR-936增加iNs的内在兴奋性。miR-936-sponge对AP和内在兴奋性的作用与miR-936相反。由于高AP阈值和高内在兴奋性是未成熟神经元的特征，这些发现提示miR-936抑制谷氨酸能神经元的电生理发育。

图2 miR-936增加iPSC衍生的神经元(iNs)的内在兴奋性和AP阈值

  3、miR-936抑制自发和诱发的兴奋性突触后电流

接下来，我们通过记录60-65天TTX (300 nM)存在下的微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)来检测miR-936是否影响突触传递。当AMPA受体拮抗剂NBQX阻断mEPSCs时，mEPSCs由AMPA受体介导(20µM)(图3A)。miR-936降低了mEPSCs的频率和振幅，而miR-936-sponge增加了mEPSCs的频率和振幅，miR-936Δ没有影响(图3A-C)。为了有效地诱导iNs之间的突触传递，我们生成了一个表达通道视紫红质(ChR2)和tdTomato荧光蛋白的iPSC细胞系，分别诱导动作电位和细胞可视化。将含和不含ChR2的iPSC共培养，在ChR2+细胞中，473nm光照(0.5 mW/mm2)诱发APs，在不含ChR2的iNs中，自发EPSCs的频率在光刺激下增加。这些结果表明，光刺激可诱导AP和iNs之间的突触传递。将ch2 -iPSCs与单独表达GFP的慢病毒转导的iPSCs或与miR-936、miR-936Δ、miR-936-sponge或Scr-Sponge共同培养，用473 nm光脉冲(脉冲持续时间5 ms, 0.5 mW/mm2)刺激产生EPSCs。miR-936降低了AMPA受体介导的电流(EPSC_AMPA)， miR-936-sponge增加了EPSC_AMPA，它们对NMDA受体介导的电流(EPSC_NMDA)没有影响。miR-936Δ和Scr-Sponge对EPSC_AMPA或EPSC_NMDA没有影响(图3E-G)。

为了评估突触前释放的可能性，我们用表达GFP的慢病毒单独或与miR-936、miR-936Δ、miR-936-sponge或Scr-Sponge一起转导ch2 -iPSCs，然后将其与未经修饰、未转导的iPSCs共同培养。在非荧光iNs中记录光学诱发的EPSC(图3H)。配对脉冲比(PPR)是由一对刺激物诱导的第二反应与第一反应的比率，在所有组中都具有可比性(图3J)，排除突触前释放概率是导致miR-936过度表达细胞mEPSC频率降低的原因。此外，通过PSD-95和Bassoon双染色评估的突触数量在miR-936中减少，在miR-936-sponge中增加，而在miR-936Δ或Scr-Sponge中保持不变(图3K和3L)。总之，这些结果表明miR-936抑制自发和诱发的AMPA受体介导的突触传递，并减少突触数量。

图3 miR-936降低兴奋性突触后反应并限制突触数量

     4、miR-936通过TMOD2调节突触传递和突触数量

为了研究miR-936调节突触的机制，我们检测了通过TargetScan识别的潜在miR-936靶点。TMOD2是一个具有多个miR-936结合位点的预测靶点，它是一种肌动蛋白结合蛋白，在长期突触抑制期间参与树突棘的形态重塑，我们证实TMOD2是miR-936在iNs中的一个靶点。我们用表达TMOD2或TMOD2 siRNA的慢病毒转导iNs，发现TMOD2降低了R_in、AP阈值，增加了基强度、AP数量(图4A-D)。TMOD2提高mEPSCs、EPSC_AMPA 和突触数量的幅度和频率(图4E-L)。TMOD2 siRNA对这些测量结果有相反的影响，EPSC_NMDA在各组中具有可比性(图4H-J)。此外，miR-936和miR-936-sponge的作用被TMOD2或TMOD2 siRNA阻断(图5A-G)。这些结果表明，TMOD2作为miR-936的靶点对iNs的电生理特性和突触数量有相反的影响，并至少部分介导了miR-936对突触的影响。

图4 TMOD2对iNs电生理特性和突触数量的影响

图5 TMOD2逆转了miR-936对电生理特性和突触数量的影响

讨论

本研究检测了miR-936的功能。miR-936是精神分裂症患者DLPFC中增加的一种miRNA，它位于人类的第10号染色体上。研究表明，miR-936在神经元中表达，且miR-936表达增加至少部分通过TMOD2改变了突触数量、AMPA受体介导的电流和谷氨酸能iNs的内在兴奋性。我们早期使用下一代测序的研究表明，精神分裂症患者的DLPFC中miR-936升高约2倍，且其在DLPFC皮层呈非均匀分布模式，在第2/3层表达最高。我们使用人类iNs是因为miR-936只存在于灵长类动物中。虽然miR-936过表达不影响被动膜性质，但它增加了AP阈值和内在兴奋性，并降低了自发和诱发的突触传递，这些结果表明，miR-936抑制神经发育。

精神分裂症患者DLPFC的树突棘密度降低，尤其是在第3层，而miR-936升高导致谷氨酸能神经元突触传递和突触数量减少，这一发现提出了一个有趣的可能性，即miR-936可能参与精神分裂症的突触病理。我们证实TMOD2是miR936在iNs中的靶基因。TMOD2是一种肌动蛋白结合蛋白，在中枢神经系统中表达，并且文献报道TMOD2会增加突触数量。本研究发现TMOD2消除了miR-936对内在特性、突触传输和突触数量的影响，表明TMOD2对miR-936的影响至关重要。

综上所述，本研究表明miR-936上调影响突触数量和突触功能，因此其可能参与了精神分裂症的突触病理。

END

原文：Panja D, Li Y, Ward M E, et al. miR-936 is Increased in Schizophrenia and Inhibits Neural Development and AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission[J]. Schizophrenia Bulletin, 2021, 47(6): 1795-1805. 

翻译：王新霞

审核：李    月

排版：毛悟宇