调节miR-142-5p/PTPN1介导的Akt通路可以改善阿尔茨海默病大鼠的学习和记忆能力

背景

阿尔茨海默病（AD）作为一种多因素疾病，其特点包括记忆力衰退，定向力障碍，自理能力缺失和人格改变。AD是全球第五大死亡原因，造成超过5000万人死亡。然而目前的治疗方法都不能有效治疗或减缓AD的进展。因此，探索治疗AD的新方法具有重要意义。

MicroRNA（miRNAs）是一类参与转录后基因表达调控的内源性非编码单链RNA分子。多项研究表明，miR-142-5p在AD脑组织中异常表达，其参与AD的发病，这可能与Aβ介导的突触功能障碍有关。miRNA有望成为AD的候选生物标记物。非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶1（TPN1）在生物信息学网站上被选为miR-142-5p的靶点。有研究表明miR-142-5p可以负性调节PTPN1的表达，PTPN1可以激活PI3K/Akt途径，而miR-142-5p通过调节PTPN1/Akt轴在AD中发挥作用的机制尚未被广泛探讨。因此，本研究旨在探讨如何调节miR-142-5p/PTPN1介导的Akt通路以改善AD大鼠的学习记忆。

方法

1、实验动物：雄性SPF大鼠

2、AD模型的建立与分组：侧脑室脑立体定位注射1 μL Aβ1-42（5 μg/μL）建立AD模型。将造模成功的大鼠分为7组（每组15只）：1.AD组（注射50μL无菌生理盐水）；2. miRNA抑制空载体组（注射miR-142-5p 拮抗剂的空载体）；3. miR-142-5p抑制组（注射miR-142-5p拮抗剂）；4. PTPN1过表达空载体组（注射PTPN1过表达的空载体）；5. PTPN1过表达组（注射PTPN1过表达载体）；6. miR-142-5p抑制+PTPN1抑制空载体组（注射miR-142-5p拮抗剂+PTPN1抑制剂的空载体）；7. miR-142-5p抑制+PTPN1抑制组（注射miR-142-5p拮抗剂+PTPN1拮抗剂）。

3、行为学测试：Morris水迷宫实验。

结果

1、降低miR-142-5p或升高PTPN1

可改善AD大鼠的行为

为了研究miR-142-5p调节PTPN1介导的Akt信号通路对AD大鼠行为的影响，研究人员将调节miR-142-5p和PTPN1表达的载体转移到AD大鼠体内，并观察其在Morris水迷宫实验中的变化，结果显示：造模成功的AD大鼠存在逃逸潜伏期明显延长，游泳路线混乱、冗长且毫无目的，跨平台次数减少、原始平台象限停留时间的比例降低的特点。抑制miR-142-5p或过表达PTPN1可以缩短逃逸潜伏期，使游泳路线缩短且有目的，跨平台次数增加、原始平台象限停留时间的比例增大；同时抑制miR-142-5p 和 PTPN1则延长其逃逸潜伏期、使游泳路线明显延长且更加紊乱、缩短跨平台次数和停留时间。结果表明抑制miR-142-5p或过表达PTPN1可以在一定程度上改善AD大鼠的学习记忆能力（图1）。

图1 降低 miR-142-5p或升高PTPN1改善AD大鼠的行为。A.逃避潜伏期；B.游泳路线；C.跨平台的次数；D.原始平台象限停留时间的比例。

2、AD中存在miR-142-5p上调

和PTPN1下调

miR-142-5p的异常表达可能参与AD的发病机制。结果表明，AD大鼠存在miR-142-5p升高和PTPN1降低（图2A）。为了进一步研究miR-142-5p和PTPN1之间的调节机制，研究人员通过Starbase网站预测了miR-142-5p和PTPN1的结合位点并利用双荧光素酶实验证实了miR-142-5p与PTPN1的靶向关系（图2B）。结果表明，转染miR-142-5p-mimic和PTPN1-WT的细胞荧光素酶活性降低，而转染PTPN1-MUT的细胞荧光素酶活性没有改变，表明miR-142-5p可以靶向PTPN1。

为了进一步研究miR-142-5p对PTPN1的调节作用，检测了AD大鼠PTPN1和miR-142-5p的表达。结果表明，注射miR-142-5p拮抗剂降低了miR-142-5p的表达，同时提高了PTPN1的表达；注射PTPN1过表达载体提高了大鼠脑组织中PTPN1的表达（图2C）。通过Western blot分析检测PTPN1蛋白的表达（图2D），结果显示PTPN1蛋白在AD大鼠中降低，但抑制miR-142-5p或过表达PTPN1后升高，抑制PTPN1后降低。

图2 在AD中存在miR-142-5p上调和PTPN1下调。A. RT-qPCR检测AD大鼠中miR-142-5p和PTPN1的表达；B. Starbase网站预测miR-142-5p和PTPN1之间的结合位点，并通过荧光素酶活性测定验证miR-142-5p和PTPN1之间的相互作用；C.RT-qPCR检测MiR-142-5p和PTPN1的表达；D.Western blot分析检测到PTPN1蛋白变化。

3、下调miR-142-5p/上调PTPN1可以有效抑制Aβ的形成和p-tau蛋白的异常磷酸化

为了验证miR-142-5p以PTPN1为靶点，抑制miR-142-5p可以有效抑制Aβ的形成和p-tau蛋白的异常磷酸化，研究人员在AD大鼠脑组织中检测了Aβ和p-tau蛋白的表达（图3A-C）。结果表明，Aβ和p-tau蛋白在AD大鼠中增加，抑制miR-142-5p或过表达PTPN1后减少，抑制PTPN1可以逆转抑制miR-142-5p对Aβ和p-tau蛋白的影响。上述结果表明，miR-142-5p可以负性调节PTPN1的表达，抑制miR-142-5p可以有效抑制Aβ的形成和p-tau蛋白的异常磷酸化。

图3 下调miR-142-5p/上调PTPN1可以有效抑制Aβ的形成和p-tau蛋白的异常磷酸化。A-C免疫组化检测大鼠脑组织中Aβ和p-tau蛋白的表达。

4、抑制miR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠脑组织炎症的抑制作用，提高脑组织细胞的存活率

研究人员推测抑制miR-142-5p可能通过调节PTPN1的表达来促进对大鼠脑组织炎症因子的抑制，并在细胞活动中发挥保护作用。应用ELISA测定IL-1β和TNF-α水平作进一步验证（图4A）。结果表明，IL-1β和TNF-α在AD大鼠中表达上调，而在抑制miR-142-5p或过表达PTPN1后下调，抑制PTPN1可以逆转抑制miR-142-5p对IL-1β和TNF-α的影响。通过Nissl染色法检测脑组织细胞的存活率（图4B）。结果显示，尼氏体数量和细胞存活率在AD大鼠或同时抑制miR-142-5p 和 PTPN1的大鼠中降低，在敲低miR-142-5p或过表达PTPN1的大鼠中升高。上述结果表明，抑制miR-142-5p或过表达PTPN1可降低AD大鼠脑组织炎症因子水平，提高脑组织细胞存活率。

图4 抑制miR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠脑组织炎症的抑制作用，提高脑组织细胞的存活率。A. ELISA检测IL-1β和TNF-α蛋白的表达；B.尼氏染色法检测脑组织细胞中尼氏体的数量。

5、下调MiR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠脑神经元凋亡的抑制作用

AD神经元凋亡的机制涉及多个方面，包括Aβ蛋白沉积、p-tau蛋白异常磷酸化、凋亡相关基因表达障碍（Bax、Bcl-2）、胶质细胞活化和炎症因子合成与分泌（IL-1β、TNF-α）以及神经元异常凋亡。研究人员检测了Bax和Bcl-2表达（图5A）。结果显示在AD大鼠中Bcl-2降低，Bax升高，抑制miR-142-5p或过表达PTPN1后，Bcl-2上调，Bax降低。抑制PTPN1可以逆转抑制miR-142-5p的作用。研究人员还检测了脑组织细胞凋亡情况（图5B），脑组织细胞凋亡率在AD大鼠中加快，抑制miR-142-5p或过表达PTPN1后降低，抑制PTPN1可以逆转抑制miR-142-5p的作用。结果证明下调miR-142-5p或上调PTPN1可以抑制AD大鼠脑神经元的凋亡。

图5 下调MiR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠脑神经元凋亡的抑制作用。A. RT-qPCR检测Bax和Bcl-2表达；B.TUNEL染色检测脑细胞凋亡。

6、下调MiR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠学习和记忆能力的改善作用

研究人员通过Western blot分析检测AD中p-Akt表达（图6），结果表明，p-Akt\/Akt在AD大鼠中降低，抑制miR-142-5p或过表达PTPN1上调后增加，抑制PTPN1后下降。结果表明抑制 microRNA-142-5p 后PTPN1表达升高，PTPN1可以通过激活PI3K/Akt途径改善阿尔茨海默病大鼠的学习和记忆能力。

图6 下调MiR-142-5p可促进PTPN1对AD大鼠学习和记忆能力的改善作用，发挥抗AD作用。Western blot分析检测p-Akt/Akt蛋白表达。

讨论与结论

AD是最常见的神经退行性疾病，也是痴呆症的主要原因。MiRNAs被认为是AD的候选生物标志物，其中miR-142-5p在AD中的作用机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨如何通过调节miR-142-5p/PTPN1介导的Akt通路来改善AD大鼠的学习记忆功能。

本研究和既往研究结果一致，经Aβ1-42诱导的AD患者中，miR-142-5p表达升高。miR-142-5p在AD进展中的作用表现为：抑制miR-142-5p的表达可以改善AD大鼠的行为缺陷，减轻大鼠脑组织中Aβ形成、p-tau蛋白异常磷酸化、炎症反应和神经元凋亡，提高AD大鼠神经细胞的存活率。既往研究中也证明了Aβ1-42可以增加神经元中miR-142-5p的表达，miR-142-5p表达增加会促进细胞凋亡。小檗碱可以抑制miR-142-5p表达，而抑制miR-142-5p可以改善Aβ诱导的突触功能障碍和神经元损伤。

本研究发现在AD大鼠中PTPN1表达降低，上调PTPN1可以逆转miR-142-5p对AD的影响。在其他研究中得到的类似结果如下：下调PTPN1会导致突触传递和可塑性缺陷、tau过度磷酸化、Aβ蛋白异常积聚和记忆功能损伤，而PTPN1的上调可有效恢复这些缺陷。

此外，本研究还发现AD大鼠表现出Akt途径失活，既往研究表明AD患者外周血淋巴细胞中Akt、PI3K和p-Akt水平降低。Akt信号通路的激活可以降低p-tau磷酸化水平，这可能有助于治疗AD。药物激活Akt信号通路可以改善AD动物模型的记忆损伤和突触可塑性异常，表明Akt与治疗AD记忆损伤密切相关。

综上，本研究发现抑制microRNA-142-5p后PTPN1表达升高，PTPN1可以通过激活PI3K/Akt途径改善阿尔茨海默病大鼠的学习和记忆能力，从而发挥抗AD的作用，这为探索AD的相关通路提供了一种新的分子机制。

原文丨Liang W, Xie Z, Liao D, et al. Inhibiting microRNA-142-5p improves learning and memory in Alzheimer’s disease rats via targeted regulation of the PTPN1-mediated Akt pathway[J]. Brain Research Bulletin, 2022. https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2022.02.016

翻译丨张柯馨

审核丨李   月

排版丨毛悟宇