再创丨号称新一代CAR T的SUPRA CAR系统是如何设计的？
CAR T是近年来研究较为深入的免疫疗法之一，使其成为一种可调控、可编程的智能癌症治疗手段是研究人员想要实现的目标。
为了更有效精确地调控CAR T细胞的免疫反应，研究人员开发了一种拆分的，通用的并且可编程的CAR T系统：SUPRA CAR。此系统相比于传统的CAR T系统有更好的灵活性、可控性以及特异性，比如此SUPRA CAR系统不需要重新工程改造T细胞就能靶向新的抗原靶点，能够对T细胞的激活反应进行微调，可以感知并且逻辑响应多种抗原信号。这些特点在对抗信号衰减，避免过度的T细胞激活反应，并且增强肿瘤识别特异性方面具有重要的意义和应用价值。
作者：陈泽华 孟凡康
校对：邓婷月 孙智 张益豪
全文约5000字，阅读时间约为15分钟
尽管CAR T技术带来的癌症治疗效果有目共睹，但安全性和有效性仍然是CAR T疗法面临的重大障碍。为了提高CAR T细胞疗法的安全性和有效性，我们急需在T细胞激活水平调节、靶向特异性、信号通路调控等方面优化CAR T系统。
目前的CAR T细胞具有以下几点弊端：
1. 传统的CAR T设计包含一个scFV（抗体单链可变结构）和细胞内信号结构域（CD3z和共刺激结构域）。但这种固定化设计使得我们每次都需要重新改造T细胞才能使其实现新的功能，同时这也使得我们难以控制CAR T细胞的免疫激活水平和T细胞相关的细胞毒性。
2. 除了限制了CAR T细胞的可控性，这种固定的CAR设计同样限制了CAR T细胞的抗原特异性和亲和性。CAR T设计中通常应用与抗原具有高亲和力的scFV来保证其能高效地识别并结合肿瘤细胞的抗原。然而这些高亲和力的抗体往往无法区分靶细胞抗原的密度，从而对能低水平表达相同抗原的健康细胞产生严重的免疫反应。而低亲和力的scFV虽然可以更好的进行不同细胞抗体密度的区分，但是在识别抗原的特异性方面有所下降。因此，相比于改变scFV的的亲和性，提高CAR T细胞特异性上更好的策略可能是对CAR组成进行模块化设计。
3. 有研究表明独立调控第一信号区域和共刺激区域可以优化T细胞反应，此外，将共刺激区域分开激活可以让T细胞展现不同的功能和表型（如T细胞分化、记忆T细胞形成）。因此设计CAR T系统使其可以独立控制不同的信号通路具有重要的价值。这一点也是传统CAR T系统不具备的。
4. T细胞亚群的组成（比如CD4+和CD8+T细胞的比例）在增强CAR T细胞抗肿瘤反应中是非常重要的参数。考虑到我们的免疫系统含有多种不同效应功能的T细胞亚型，独立调控不同类型的T细胞很可能是优化CAR T细胞疗法的另一种策略。传统CAR T的固定化设计无法实现对不同信号结构域或者不同T细胞亚型的独立的、可诱导的激活，无法针对不同的患者实现多种T细胞免疫响应。
为了增加CAR T疗法的安全性和有效性，目前已经有一些设计的CAR T系统被用来提高它的可控性、灵活性、特异性。比如设计药物诱导型的ON/KILL开关来调控CAR T活性；将胞外抗原识别模块和胞内信号模块分开来增强其灵活性；使T细胞同时表达两个不同的嵌合抗原受体增加对肿瘤识别的特异性。但是，这些设计并没有任何一个能够同时解决上面所说的传统CAR T的4种问题。
2018年4月26日，《Cell》在线发表题为Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses的文章，SUPRA CAR系统横空出世。之后SUPRA CAR被多家科技媒体评为新一代的CAR T免疫疗法，引起了广泛的关注。
总体来说，SUPRA CAR系统具有以下特点：
△SUPRA CAR系统是拆分的、通用的、可编程的；
△SUPRA CAR系统能够对T细胞激活反应的强度进行调节从而减轻副作用；
△SUPRA CAR系统能够感知并且逻辑响应多种抗原信号；
△SUPRA CAR系统能够调控不同免疫细胞类型的信号通路；
那么SUPRA CAR系统是如何设计的呢？接下来我们将会进行详细的解读。
01
SUPRA CAR系统的设计和特征参数
SUPRA CAR系统由两部分组成：在T细胞内稳定表达的通用受体（zipCAR）以及识别肿瘤抗原的scFV配体（zipFV）。zipCAR通用受体融合了胞内信号区域和亮氨酸拉链，zipFV配体融合了亮氨酸拉链和scFV。（亮氨酸拉链的结构是由2-5个a螺旋扭曲成的超螺旋结构。当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链）zipFV的scFV识别并结合肿瘤抗原，亮氨酸拉链结合并激活T细胞的zipCAR。
图1：SUPRA CAR系统的简要介绍。
不同于固定的CAR T设计，SUPRA CAR系统能在不用重新改造人体T细胞的前提下靶向多种抗原。研究人员在CD8+ T细胞中表达了RR zipCAR，同时设计了三个不同的zipFV分别靶向三种常见的肿瘤抗原（a-Her2, a-Axl,a-Mesothelin）。结果证明当加入对应的zipFV时，CD8+zipCAR T细胞能成功杀死肿瘤细胞。
图2：SUPRA CAR系统能在不用重新改造人体T细胞的前提下靶向多种抗原
SUPRA CAR系统的可调参数具有以下几个方面：
（1）亮氨酸拉链间的亲和性。通过设计三个对RR zipCAR有不同程度亲和性的zipFV（scFV相同，但亮氨酸拉链不同：a-Her2-EE/SYN5/SYN3）来观察T细胞的激活水平，实验结果表明亮氨酸链间的亲和性越强，EC50（T细胞分泌细胞因子达到1/2最大值所需要的zipFV剂量）越低，细胞因子分泌的越多，T细胞毒性越强。
（2）肿瘤抗原和scFV之间的亲和性。通过对12个不同zipFV（3个不同的亮氨酸拉链和4个对Her2有不同结合常数的scFV进行任意组合）进行测试发现肿瘤抗原和scFV之间的亲和性对T细胞的激活贡献不大，而亮氨酸拉链的亲和性能显著提高T细胞的激活水平。
（3）zipFV的浓度。zipFV浓度越高，细胞因子分泌越多，到达阈值时细胞因子的分泌量稳定在最高水平
（4）zipCAR的表达水平。zipCAR表达水平高的细胞在被激活时能分泌更多的细胞因子。
综上所诉，为了解决临床中出现的因CRA T细胞过度激活而产生的细胞毒性，SUPRA CAR系统能通过调节多个参数来调控T细胞的激活水平。
图3：SUPRA CAR系统的可调参数
02
引入竞争性机制来调节SUPRA CAR系统活性
因为很多接受CAR T细胞疗法的患者都面临着因细胞因子释放综合症而威胁到生命的问题，所以需要在必要的时候阻断T细胞的活性。在这项工作中研究人员选择加入竞争性的zipFV来抑制SUPRA CAR T细胞的激活水平。通过加入对EE zipFV有不同亲和性的竞争性zipFVs，研究人员成功地降低了SUPRA CAR T细胞的激活水平，降低了细胞因子的释放。
利用竞争性机制，研究人员发现通过加入对EE zipFV有强亲和性的SYN4 zipFV来抑制体外CD8+ T的激活，通过加入对EE zipFV有较弱亲和性的SYN47 zipFV和SYN13 zipFV可以调节体外CD8+ T的激活水平。
图4：SUPRA CAR系统引入竞争性机制来调节T细胞激活反应强度
03
SUPRA CAR系统可以实现逻辑调控
为了解决抗原逃逸，CAR T细胞疗法有时候会使用双抗原识别受体来靶向肿瘤细胞。但是肿瘤细胞的高突变性使其仍然能够舍弃能被识别的抗原从而实现免疫逃逸。
如果利用传统的CAR T系统，T细胞需要被重新改造，而通过SUPRA CAR平台，我们能够在不需要进一步进行基因改造的前提下靶向多种肿瘤抗原。实验证明，不论是加入识别一种抗原的zipFV（a-Her2或者a-Axl,）,还是同时加入识别两种不同抗原的zipFV（a-Her2和a-Axl,）,SUPRA CAR系统都能够很好地发挥作用，这表明SUPRA CAR系统具有阻止肿瘤抗原逃逸的巨大潜力。
图5：SUPRA CAR系统实现“OR”逻辑门
肿瘤免疫疗法的另一限制因素是其很难识别单个的肿瘤特异性抗原，而SUPRA CAR系统可以达到“细胞筛选器”的功能，只能特异性地杀死单独表达Her2抗原的目标细胞，而过滤掉表达Her2和Axl两个抗原的细胞。
为了实现这个目标，研究人员设计了“非与”的逻辑门：当细胞表面有两个抗原（Her2和Axl）时，抗原抗体的结合使a-Axl-SYN2zipFv 和a-Her2-EE zipFv距离拉近，互补的亮氨酸拉链结合从而阻断了T细胞的激活，抑制了细胞因子的释放；当细胞表面只表达一个抗原（Her2）时，a-Axl-SYN2 zipFv不能结合在细胞表面，a-Her2-EE zipFv能成功结合zipCAR并激活T细胞大量产生强烈的细胞毒性。
图6：SUPRA CAR系统实现“细胞筛选器”—Cell Selector的功能
04
SUPRA CAR系统体内肿瘤清除的效果
研究人员在免疫缺陷型小鼠体内分别移植了SK-BR-3 乳腺癌症细胞(Her2+)以及改造过的Jurkat T血液肿瘤细胞（Her2+），培养一段时间后注射能表达RR zip CAR的CD8+T细胞（或者加入传统的Her2 CAR），随后每隔1-2天注射a-Her2-EE zipFv，数据和照片结果显示相比于不注入任何T细胞和只注入表达RR zip CAR的CD8+T细胞的对照组而言，SUPRA CAR系统能够很好的杀死并清除肿瘤细胞，作用效果相比于传统CAR T细胞并没有降低。
图7：SUPRA CAR系统体内清除癌症细胞的效果
除此之外，为了尽量降低可能存在对于合成的亮氨酸的免疫排斥，研究人员融合了来自人体的FOS和JUN转录因子的拉链区域，组成新的FOS zipCAR和JUN zipFV，实验结果证明无论在体内还是体外，这个来自人体内的SUPRA CAR系统的效率都和合成的一样好。
图8：人源FOS zipCAR和JUN zipFV的效果与合成的zipCAR效果对比
05
调控参数控制SUPRA CAR系统在体内的活性
如何控制体内CAR T细胞表达的细胞因子水平对于防止细胞因子释放综合症具有重要意义。研究人员利用三个策略控制体内细胞因子的表达：
（1）控制zipFV的注射剂量。结果表明，zipFV的注射剂量大于2mg/kg可以更好更快地清除肿瘤细胞。虽然zipFV的注射剂量在0.5mg/kg和 2mg/kg之间以及在4mg/kg和8mg/kg之间时对肿瘤清除效果相差不大，但zipFV的注射剂量越大，细胞因子分泌的越多。
（2）改变亮氨酸拉链的亲和性。正如体外结果所展示的，体内细胞因子的表达量与亮氨酸拉链的亲和性呈正相关。亮氨酸拉链的亲和性越强，体内细胞因子分泌越多。
（3）引入竞争性zipFV来抑制SUPRA CAR从而减少细胞因子的分泌。加入具有较强竞争性的zipFV时，细胞因子的分泌量显下降；当加入没有竞争作用的对照zipFV时，体内细胞因子的释放不受影响。这些体内细胞因子表达量的结果表明SUPRACAR系统可以通过多种途径调节细胞因子的释放，从而减轻细胞因子释放综合症以及其他由于传统CAR T细胞疗法而引起的毒性。
图9：SUPRA CAR系统可以通过三种策略控制体内细胞因子的表达水平
06
利用正交的SUPRA CAR实现对不同信号区域的独立控制
SUPRA CAR系统的一个关键属性在于多种正交的SUPRA CAR系统可以在一个细胞中调控多个信号通路，实现T细胞信号传递和响应的高度自定义化调节。研究人员设计了两个正交的SUPRA CAR来独立调控不同的信号通路：FOS zipCAR（结合a-Her2-SYN9 zipFv）只包含CD3Z区域，RR zipCAR(结合a-Axl-EE zipFv)包含共刺激信号区域CD28和4-1BB。通过对比在a-Axl-EEzipFv和a-Her2-SYN9 zipFv的浓度下CD69的表达量以及细胞因子的释放量，研究人员验证了SUPRA CAR系统的正交性可以帮助我们实现对于不同信号区域的独立控制。
图10：SUPRA CAR系统可以实现对不同信号区域的独立控制
07
正交的SUPRA CAR实现对不同类型T细胞的控制
不同的T细胞亚型能够实现不同的功能，CD4+T细胞能帮助T细胞分泌细胞因子，调控免疫反应，CD8+ T细胞则能够直接杀死癌症细胞。独立控制两种细胞来促进不同的T细胞反应可以进一步地增强CAR T细胞疗法的效果。为了验证SUPRA CAR系统的正交性能否在不同T细胞中实现，研究人员设计CD4+T细胞表达RR zipCAR（结合a-Axl-EE zipFv），而CD8+T细胞表达FOS zipCAR（结合a-Her2-SYN9 zipFv）。结果证明SUPRA CAR系统可以实现对不同T细胞的独立控制，同时，CD4+T和CD8+T细胞的同时激活大大提升了细胞因子的表达量。
图11：正交的SUPRA CAR可以实现对不同类型T细胞的控制
再创丨Regenesis 编辑部点评
SUPRA CAR系统具有调整T细胞的激活水平，增强对肿瘤的特异性，可独立控制不同的信号通路和细胞类型等能力。其充分利用了合成生物学中“模块化”的概念，将传统的CAR T系统拆分为胞内信号模块，亮氨酸拉链模块以及胞外抗原抗体识别模块，使我们能在多个层次和多重逻辑上对T细胞的激活水平做出调整，极大地提高了CAR T系统的可控性，灵活性以及特异性，打破了传统CAR T系统存在的诸多限制和壁垒。
参考文献：
Cho, Jang Hwan, James J. Collins, and Wilson W. Wong. "Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses." Cell (2018).